摘要
地下水中的砷浓度和形态受到微生物活动的显著影响和调控。奎屯河流域是典型的高砷区，而对奎屯河流域地下水中的砷代谢相关微生物代谢特征的研究尚显匮乏。本研究在奎屯河流域采集了11组地下水样本进行宏基因组测序，分析高砷和低砷地下水化学特征以及砷代谢相关微生物的群落结构和功能基因与环境因子之间的关系。结果表明，本研究区地下水的优势门为变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、浮霉菌门（Planctomycetota）。在属水平上，低砷组样品的微生物群落展现出显著的物种丰富度和多样性优势。亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas）、硫杆菌属（Thiobacillus）、Sulfuritalea丰度与砷浓度呈显著正相关。本研究共注释到砷甲基化功能基因、As(Ⅲ)氧化功能基因、As(V)还原功能基因及砷运输功能基因12种。砷浓度与砷酸盐还原基因和有机砷氧化基因呈显著负相关关系，与亚砷酸甲基转移基因呈显著正相关关系。砷浓度会抑制砷代谢微生物群落和功能基因的丰度和多样性，对微生物群落具有选择压力，使具有砷抗性的微生物在高砷环境中富集。研究区地下水微生物存在多种砷代谢途径，包括砷甲基化、砷氧化还原和砷外排，其中，砷甲基化是该流域高砷地下水中微生物砷代谢的主要途径。砷代谢微生物群落和功能基因与砷浓度之间的关系受到多种环境因素的调控和影响，而不是受单因子调控。本研究通过筛选具有砷代谢能力的微生物种群及其关键功能基因，不仅深化了对砷代谢机制的理解，还为砷污染的生物修复提供了新策略。
Abstract
It is evident that microbial activities have a considerable impact on the concentration and speciation of arsenic in groundwater, thereby playing a pivotal role in its regulation. Despite its status as a region with a notable arsenic presence, the Kuitun River Basin has received scant research attention with regard to the metabolic characteristics of arsenic-metabolising microorganisms in its groundwater. This study procured 11 groundwater samples from the Kuitun River Basin for metagenomic sequencing, and analyzed the chemical characteristics of both high- and low-arsenic groundwater, as well as the associations between the community structure and functional genes of arsenic-metabolizing microorganisms and various environmental factors. The results of the study indicated that the predominant bacterial phyla present in the study area's groundwater were Proteobacteria, Actinobacteria, and Planctomycetota. At the genus level, low-arsenic samples exhibited a notable advantage in species richness and diversity. Furthermore, the abundances of Nitrosomonas, Thiobacillus, and Sulfuritalea were found to be significantly positively correlated with total arsenic (As) concentrations. A total of 12 functional genes associated with arsenic methylation, arsenite (As(Ⅲ)) oxidation, arsenate (As(V)) reduction, and arsenic transport were annotated. That the concentrations demonstrated a substantial negative correlation with arsenate reductase gene and organic arsenic oxidase gene, while concurrently exhibiting a significant positive correlation with arsenite methyltransferase gene. The presence of arsenic in the environment had a significant impact on the proliferation and diversity of microbial communities responsible for arsenic metabolism. This impact was characterized by the exertion of inhibitory effects on the abundance and diversity of arsenic-metabolizing microbial communities and the functional genes that facilitate this process. Consequently, this resulted in the selective pressure on the microbial community, leading to the enrichment of arsenic-resistant microorganisms in environments with elevated levels of arsenic. The study area's groundwater microorganisms were observed to demonstrate a variety of arsenic metabolic pathways, encompassing arsenic methylation, arsenic redox reactions, and arsenic efflux. Among these, arsenic methylation was identified as the primary pathway of microbial arsenic metabolism in high-arsenic groundwater within this basin. The relationships between arsenic-metabolizing microbial communities and functional genes, and arsenic concentrations, were regulated and influenced by multiple environmental factors rather than a singular one. By means of screening microbial populations that are capable of arsenic metabolism, in conjunction with their key functional genes, this study has not only deepened our understanding of arsenic metabolism mechanisms, but also provided novel strategies for bioremediation technologies that are aimed at addressing arsenic pollution.
砷（As）作为一种极具毒性的类金属元素，常常潜藏于矿物之中。矿物中的砷经过水文及生物地球化学过程，释放到地下水中，从而在某些地区形成了天然存在的高砷地下水问题[1]。这些水体中的砷浓度远远超出了世界卫生组织（WHO）所设定的饮用水安全标准（10 μg/L）[2]。砷在地下水中的存在形态并非固定不变，而是受到一系列环境因素的调控，包括水体的温度、酸碱度（pH值）以及微生物的活跃程度等。这些因素相互作用，共同影响着砷在地下水中的溶解性、迁移性和生物可利用性，从而增加了其对环境和人类健康的潜在威胁。由于砷进入人体是无法被察觉的，且无机砷在人体内不具有任何有益的代谢功能，因此，许多人在不自知的情况下长期接触砷，从而引起皮肤、血管、神经系统疾病，以及多种类型的癌症[3-4]。原生高砷地下水的污染问题普遍存在，全球多个地区存在高砷地下水问题，这些地区主要集中在亚洲[5]、南美洲[6]和非洲[7]的某些区域，如孟加拉国[8]、越南[9]、柬埔寨[10]等，以及我国的大同盆地[11]、河套平原和松嫩平原等[12-14]。新疆奎屯垦区是中国内地第一个出现地方性砷中毒的地区[15-17]。长期饮用高砷地下水会引起慢性砷中毒，严重危害当地居民的身体健康。经水源改造后有一定成效，但高砷地下水仍被用于农田灌溉，砷元素通过农作物间接被人体吸收并在体内积累，导致当地居民体内砷含量水平偏高[18]。因此，研究地下水中的砷代谢过程，对缓解当地居民砷中毒现象具有重要现实意义。
地下水中砷的代谢途径主要包括甲基化、迁移和氧化还原转化。高砷地下水中的微生物对砷具有调控作用，它们能够通过各种生物地球化学过程影响砷的形态和迁移。研究表明砷酸盐异化还原菌（dissimilatory arsenate-respiring prokaryote，DARP）能够将高价态的砷还原为低价态的砷，从而影响砷的生物有效性和毒性[19]。微生物还能够通过吸附（真菌KR21-2）、甲基化（青霉Penicilluium）等过程影响砷在含水层中的释放和转化[20]。微生物对高砷地下水的形成和分布有重要影响。研究表明，柠檬酸杆菌（Citrobacter sp. JH-1）、梭菌（Clostridium sp. JH-6）、微小杆菌（Exiguobacterium sp. JH-13）、类芽孢杆菌（Paenibacillus sp. JH-33）参与的铁氧化物矿物的还原性溶解是高砷地下水形成的关键过程之一[21]。在强还原环境下，微生物活动可以促进地下水中砷的释放[22]。此外，一些微生物，如铁氧化菌（iron-oxidizing bacteria，FeOB）、碳酸盐矿化菌（carbonate mineralization microorganism，CMM）和硫酸盐还原菌（sulfate reducing bacteria，SRB）能够通过诱导成矿的方式直接促进含砷矿物的形成或生成其他矿物间接吸附砷，从而降低水体及土壤中溶解性或可提取态砷浓度及其生物可利用性[23]。这些微生物是砷循环中不可或缺的调节者，通过不断进化的砷代谢机制影响砷的富集与迁移。而这些砷代谢过程与砷代谢基因之间存在着密切的联系。高砷环境中的微生物群落普遍携带有砷抗性基因，如arsC1、arsC2（砷酸盐还原基因）、arsH以及砷外排基因arsA（亚砷酸盐/尾锚定蛋白转运基因）、acr3（亚砷酸盐转运基因）等[24]。这些基因使得微生物能够适应高砷环境，通过还原或氧化砷来降低其毒性。As（V）的还原过程通常涉及到特定的砷还原酶，如ArsC型和ArrAB型还原酶[25]。这些酶能够催化As（Ⅴ）与电子供体（如有机物或无机物）反应，生成As（Ⅲ）。例如，厌氧砷酸还原菌（Pantoea sp. IMH）在砷还原过程中表现出高效的砷还原能力，其arsH、arsC、arsB（砷化物外排基因）和arsR（砷酸盐/亚砷酸盐转录调节基因）等基因片段起到主要的调控作用[26]。微生物通常通过特定的氧化酶，如aoxAB（亚砷酸盐氧化基因）基因编码的亚砷酸氧化酶，在有氧条件下完成As（Ⅲ）的氧化过程。亚砷酸氧化菌（Sinorhizobium sp. GW3）就是一种已知的能够氧化亚砷酸盐的细菌，其aoxAB基因参与了这一过程[27]。
已有研究表明，微生物对高砷地下水中砷的代谢过程影响显著，然而对奎屯河流域地下水中微生物的砷代谢过程所知甚少，尤其是砷浓度对微生物群落和砷代谢基因变化的影响方面。因此，本文采用宏基因组学方法，分析砷浓度对砷代谢微生物群落和功能基因的影响，以及砷代谢相关微生物群落和砷代谢功能基因与环境因子之间的关联。研究高砷地下水中砷代谢微生物群落组成，筛选出具有高效砷代谢能力的微生物菌株，对于砷污染土壤、水体等环境的生物修复以及人类饮用水安全保障具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 研究区概况
研究区奎屯河流域（43°33′~45°00′N，83°30′~85°08′E，图1）是一个典型的高砷区，位于新疆天山北坡中部，准噶尔盆地西南缘，乌鲁木齐以西220 km。该地区属于大陆性北温带干旱气候，是新疆北部光热量最丰富、无霜期最长的地区之一。该地区的气候特征显著，降水主要集中在6—8月之间，年均降水量仅为162.6 mm，而年均蒸发量则高达1208.3 mm[28]。
图1研究区流域位置
Fig.1Location of the study area watersheds
在水文地质方面，奎屯河流域北部较低、南部较高，集水区面积较大。以奎屯河下游河段为分界线，可以将区域划分为南部和北部两大区域。奎屯河流域的平原地带位于南部和北部山区之间，呈漏斗形海拔变化，从南、北山山前向平原腹地逐渐降低。奎屯河流域平原区地下水属松散岩类孔隙型水，南、北山区山前地下水类型为单一结构孔隙潜水含水层，该区域的地下水流向自南向北，其主要含水层由细砂、卵砾石和砂砾混合而成，这种地质结构为地下水的储存和流动提供了有利条件[29-30]。
1.2 样品采集与检测
根据已有研究，奎屯河流域平原区自南向北砷浓度逐渐升高，研究区依据《地下水质量标准》 （GB/T14848—2017）以二泉沟水库为分界线，分为高砷区和低砷区（以砷浓度=10 μg/L为限）[31-32]。本研究于2023年5—7月期间在奎屯河流域平原区选取了11个具有代表性的地下水样品（图1），包括高砷（HA）组地下水样品5组（L1、L6X、K45、K14X、K60X）和低砷（LA）组地下水样品6组（K29X、K6X、K17X、K27、K28、K30）。
地下水样品采集严格依据《地下水质量标准》（GB/T14848—2017）执行。采集地下水样本前，先抽水20 min，待水质稳定后采集水样，采样瓶为酸洗的高密度聚乙烯瓶，水样装瓶前需先用地下水原液润洗采样瓶（至少3次）。使用0.45 μm微孔滤膜进行过滤和分装，每个点位共取3份水样：一份加入HNO3酸化至pH＜2后装入采样瓶用于Na+、K+、Ca2+、Mg2+等常规阳离子分析；一份用于SO2-4、HCO-3、PO3-4、Cl-等常规阴离子分析；一份用于Fe、Mn和As等微量元素分析。pH值、氧化还原电位（Eh）、溶解氧（DO）、温度（T）和电导率（EC）使用便携式多参数仪（HI8424、HI9146和HI98129，HANNA，Woonsocket，RI）现场测量。收集的样品贴标置于控温保温箱并尽快送至新疆第二水文地质大队实验室测定。阳离子、阴离子、总溶解固体（TDS）以及氨氮（NH3-N）的检测遵循《生活饮用水标准检验法》（GB/T5750.15750.13—2006）。
用于微生物学研究的水样收集于预先消毒的聚乙烯瓶中，使用0.22 μm无菌滤膜过滤5~10 L 地下水。滤膜上需有明显可见覆盖物，将镊子用75%的酒精消毒后在火焰上灼烧冷却，使用消毒冷却后的镊子取出含有微生物的滤膜并保存在冻存管中，封口膜封闭管口并标记，每个样品取3个重复样。立即储存在液氮罐中送往上海美吉生物有限公司进行宏基因组测序，运输时全程用干冰冷冻保存样品。
1.3 DNA提取
利用FastDNA® Spin Kit for Soil试剂盒提取过滤后滤膜上的DNA，然后检测DNA浓度和纯度。利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。使用Covaris M220将DNA片段化，通过筛选获得约400 bp的片段，用于构建PE文库。
1.4 宏基因组测序
首先使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq进行文库构建，然后利用Illumina NovaSeq平台进行宏基因组测序（上海美吉生物医药科技有限公司），使用软件fastp[33]对原始测序数据进行质控数据统计，对reads 3′端和5′端的adapter序列进行质量剪切，去除剪切后长度小于50 bp、平均碱基质量值低于20以及含N碱基的reads，保留高质量的pair-end reads和single-end reads。最后使用软件MEGAHIT[34]对优化序列进行拼接组装，筛选出≥300 bp的contigs作为最终的组装结果。本研究共生成81.56 Gb高质量数据，其中每个样本组平均为7.41 Gb。
1.5 分析方法
1.5.1 物种及功能注释
使用BLASTP将非冗余基因集与NR数据库进行比对，通过NR库关联的分类学信息数据库获得物种注释结果。使用KOBAS 2.0对功能基因根据比对结果进行功能注释。使用KO和Pathway对应的基因丰度总和计算该功能类别的丰度。
1.5.2 物种与功能组成分析
根据KEGG注释结果筛选出具有砷代谢功能基因的KEGG Orthology（KO），利用KO构建砷代谢功能基因集，对该基因集进行物种注释，筛选出具有砷代谢功能基因的微生物。结合堆叠柱形图和Heatmap图等分析方法，对各样本及分组中物种或功能组成进行解析，获得各样本和分组中优势物种或功能的组成及丰度变化等信息。使用R语言（version 3.3.1）vegan软件包（vsesion2.4.3）进行NMDS分析和作图，研究砷浓度对群落组成的影响。
1.5.3 物种与功能关联分析
使用Circos-0.67-7平台分析砷代谢微生物的生物学功能，利用KEGG Orthology（KO）对样品中的功能基因进行分类归纳，并结合已知的基因功能作为该KO的功能进行跨物种注释，根据地下水样本中微生物的种类及基因的相对丰度进行物种与功能相对丰度之间的关联分析。
1.5.4 环境因子关联分析
使用R（version 3.3.1）软件包“vegan（vsesion2.4.3）”进行VIF方差膨胀因子分析（保留多重共线性较小的环境因子）和db-RDA分析，研究环境因子对砷代谢功能基因的影响。使用R（version 3.3.1）软件包“pheatmap”进行相关性分析，通过计算Spearman秩相关系数来研究砷代谢物种/基因与环境因子之间的相关性。
2 结果与讨论
2.1 地下水地球化学特征
奎屯河流域地下水理化性质见表1。地下水样品的pH值为7.36~8.56，呈弱碱性。HA组的Eh、DO、NH3-N浓度相对LA组低，EC、TDS、As、Fe、Mn及主要离子浓度相对LA组高。HA组NH3-N浓度平均值为0.054 mg/L；DO浓度平均值为1.46 mg/L；TDS浓度范围为735~2000 mg/L，平均值为1495.20 mg/L；As浓度在16.17~104.75 μg/L之间，平均值为52.68 μg/L，超过了人体安全浓度限值。LA组的特征与HA组相反，其NH3-N浓度平均值为0.165 mg/L；DO平均值为6.22 mg/L；TDS浓度范围为92~1629 mg/L，平均值为435.50 mg/L；As浓度范围为1.42~7.89 μg/L，平均值为4.81 μg/L。
表1奎屯河流域地下水理化性质*
Tab.1Physicochemical properties of groundwater in the Kuitun River Basin
* Deep表示井深。
2.2 地下水中砷代谢微生物群落组成
在门水平上对11个地下水样品中具有砷代谢功能基因的微生物群落组成进行分析，共检测出62门地下水砷代谢微生物。从图2a可以看出，变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、浮霉菌门（Planctomycetota）、拟杆菌门（Bacteroidota）、绿弯菌门（Chloroflexi）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）、Ignavibacteriae是相对丰度最高的7个门，占整个微生物群落的大部分。其中LA组中优势菌门为Proteobacteria和Actinobacteria，最大相对丰度分别为98.1%和17.8%，HA组的优势菌门为Proteobacteria和Planctomycetota，最大相对丰度分别为87.7%和18.1%，与砷污染环境中的优势菌门相似[35-37]，说明微生物具有一定的区域相似性。Proteobacteria在每个样品中都是相对丰度最高的门，在LA组的相对丰度高于HA组，这与在河套盆地的研究结果一致，说明该菌属是地下水环境中的优势菌属，但其丰度会受到砷浓度的抑制[38]。Actinobacteria在LA组的相对丰度平均值高于HA组，且在LA组样品K29X中相对丰度最高，这可能是由于该采样点的水系密度及海拔高度等因素更利于砷迁移。研究发现，在土壤中，随着砷污染程度的增加，Actinobacteria的相对丰度呈现降低的趋势[39]，而Proteobacteria则具有更强的耐砷性[40]。Planctomycetota主要分布于HA组样品中，在HA组样品L6X中相对丰度最大，而在LA组样品K29X、K17X、K27、K28中未检测出。研究发现，在砷污染环境中，Planctomycetota 的相对丰度有所升高[41]，这表明该菌门在应对砷污染方面具有一定的适应性或优势。
所有样品中共注释到732属具有砷代谢功能基因的微生物。从图2b可知，相对丰度较高的菌属为氢噬胞菌属（Hydrogenophaga）、不动杆菌属（Acinetobacter）、发硫菌属（Thiothrix）、施氏假单胞菌（Stutzerimonas）、马赛菌属（Massilia）、鞘氨醇菌属（Sphingobium）、假单胞菌属（Pseudomonas）。其中LA组中优势菌属为Hydrogenophaga、Stutzerimonas、Massilia，最大相对丰度分别为38.6%、52.1%、36.7%，HA组中的优势菌门为Thiothrix，最大相对丰度为49.5%。
图2地下水样品中砷代谢微生物群落组成（相对丰度小于1%的合并为 others）：（a）门水平；（b）属水平
Fig.2Composition of arsenic-metabolizing microbial communities in groundwater samples: (a) phylum-level; (b) genus-level
综上，低砷环境中具有多种优势菌群且相对丰度较高，除了优势菌群外，低砷环境中还存在大量稀有菌群。相比之下，低砷环境下的微生物群落组成更加丰富。
研究表明，在砷污染环境中Hydrogenophaga具有较高的丰度[42-43]，Hydrogenophaga能够将As（Ⅲ）氧化为As（V），从而降低其毒性[44]。此外，Hydrogenophaga还参与了氮和砷的联合去除，这在地下水修复中具有重要意义[45]。研究表明，Acinetobacter的一些菌株（Acinetobacter lwoffii[46]、Acinetobacter sp. TMKU4[47]、Acinetobacter calcoaceticus[48]等）具有极高的砷抗性，能够在高浓度砷的环境中生存，并且能够通过多种机制减轻砷的危害，包括砷的吸收、转化和解毒等过程。Thiothrix在HA组样本中相对丰度较高。研究表明，在高砷、高硫化物环境中，Thiothrix通过氧化硫化物调控砷的形态与迁移[49]。
为进一步分析砷浓度对砷代谢微生物群落分布的影响，在门水平和属水平分别进行非度量多维尺度分析（NMDS），结果如图3所示。HA组和LA组的微生物群落分别各自聚类，HA组和LA组微生物群落之间存在差异，这说明砷浓度影响了砷代谢微生物的群落组成。
图3不同砷浓度下砷代谢微生物群落的非度量多维尺度分析（NMDS）：（a）门水平；（b）属水平
Fig.3Non-metric multidimensional scaling (NMDS) analysis of arsenic-metabolizing microbial communities under different arsenic concentrations: (a) phylum-level; (b) genus-level
综上所述，在低砷环境中，Hydrogenophaga、Stutzerimonas和Sphingobium等属可能通过其砷代谢能力获得竞争优势；而在高砷环境中，Acinetobacter、Thiothrix等属则通过其砷抗性和对硫化物的氧化能力来适应高砷环境。这些结果表明，高砷环境对微生物群落产生了一定的选择压力。
2.3 微生物砷代谢功能基因特征
地下水中微生物砷代谢途径主要包括甲基化、运输和氧化还原转化。基于KEGG数据库注释结果，共鉴定出12个与砷代谢相关的功能基因，分别为：砷甲基化功能基因AS3MT（亚砷酸甲基转移酶基因）、gapgh（甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因），As（Ⅲ）氧化功能基因aoxB、aoxA和arsH，As（V）还原功能基因arsC1和arsC2，As运输功能基因arsA、acr3、arsJ（1-砷-3-磷酸甘油酸外排基因）和arsB，以及转录调控因子arsR。
图4为不同砷浓度下的砷代谢基因相对丰度。结果显示，转录调控因子arsR和砷运输功能基因acr3丰度较高，其次为砷还原功能基因arsC和砷甲基化功能基因AS3MT。arsR 基因具备自我调节的特性，它通常是构成操纵子的一部分，而这个操纵子还包含其他与砷解毒功能相关的ars基因[50]。砷运输功能基因arsA、acr3和arsJ在HA组样本中更为丰富，而arsB在LA组样本中相对丰度更高（2%~47%）。研究表明，在许多高砷地下水环境中，砷运输功能基因（如arsABCDHJ和acr3）是最丰富的砷代谢基因[51-52]。这说明高砷地下水环境促进了砷运输功能基因的进化与多样化。As（Ⅲ）是厌氧环境中主要的砷形态，细胞为抵抗其毒性进化出Acr3和ArsB蛋白来外排As（Ⅲ）。在氧化环境中，As（Ⅲ）易被氧化为As（V），因此，生物体进化出ArsC蛋白将As（V）还原为As（Ⅲ）并排出。在高砷环境下，ArsB和ArsAB复合物进化出能量耦合模式，利用细胞内的能量增强外排效率[53]，这说明As（Ⅲ）外排是高砷地下水中微生物的有效解毒途径。arsC1相对丰度在LA组样品中较高，而arsC2相对丰度在HA组样品中较高。但在热泉环境下，arsC的丰度分布与本研究相反[49]，这是因为在热泉环境中，除了砷浓度外，还有其他因子（如温度、pH值、氧化还原电位等）对微生物的基因表达产生影响。这些因子的综合作用可导致微生物在砷代谢方面表现出更加复杂的适应性，以适应极端环境。
图4砷功能基因在KO水平上的Circos图 （图中左侧沿逆时针方向样品点砷浓度逐渐降低，右侧沿顺时针方向基因丰度逐渐减小）
Fig.4Circos plot of arsenic functional genes at the KO level
AS3MT在HA组样本（6%~20%）中的相对丰度显著高于LA组样本（1%~10%），目前对AS3MT的研究多为论述其在人体内降低砷毒性和外排砷。研究发现，AS3MT是人体和其他真核生物中主要负责将无机砷（As（Ⅲ））转化为毒性较低的甲基化代谢物（如MMA（一甲基胂酸）和DMA（二甲基胂酸））的酶[54-55]。这一过程对于减少砷的毒性至关重要，因为这些甲基化代谢物比无机砷更易于排出体外[56]。长期的砷暴露会改变AS3MT基因的表达水平。研究发现，长期饮用高砷水的人群中，AS3MT的表达水平较高[57]。Coryell等[58]的研究表明，肠道菌群中的AS3MT和特定的微生物群在保护小鼠免受急性砷中毒中起关键作用。这说明，在高砷环境中，微生物可通过提高AS3MT的丰度来降低砷的毒性。
As（Ⅲ）氧化功能基因aoxAB是由两个亚基aioA和aioB组成的异二聚体，负责将As（Ⅲ）氧化为As（V）[59]。aoxAB的相对丰度较低且主要分布在HA组中（HA组相对丰度为16%~33%），这与意大利北部高砷地下水[51]和河套盆地高砷地下水[52]的调查结果相似。As（Ⅲ）氧化功能基因arsH的相对丰度较高，且在LA组样本中更高（1%~20%）。说明arsH在As（Ⅲ）的氧化过程中起着关键作用，研究表明，arsH基因的表达有助于在低砷环境中稳定As（V），防止其转化为毒性更强的As（Ⅲ）[60]。分别由arsJ和gapdh编码的ArsJ和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）蛋白构成了一个As（V）外排系统[61]。GAPDH催化无机砷向五价有机砷（1As3PGA）转化，而ArsJ是一种外排渗透酶，可将1As3PGA从细胞中排出[62]，从而形成一种有效的抗砷酸盐途径。
根据物种与功能贡献度分析（图5）发现，在属水平上，同一砷代谢基因的菌属贡献度存在差异，地下水样品中检测到的砷功能基因在Hydrogenophaga（氢噬胞菌属）、Pseudomonas（假单胞菌属）、Thiothrix（发硫菌属）、Stutzerimonas（施氏假单胞菌）以及Acidovorax（食酸菌属）中的功能种类最丰富。其中，Hydrogenophaga是aoxB和aoxA基因的主要贡献者，并且它和Acidovorax在LA样本中的贡献度更高，在河套平原碱性砷污染土壤中，这两种菌属能够进行依赖硝酸盐的As（Ⅲ）氧化反应，而aoxB基因能够促进As（Ⅲ）向As（V）氧化，并与硝酸盐还原过程形成紧密的耦合关系[63]。这种氧化过程对于降低砷的毒性和提高其在水体中的稳定性具有重要意义。Pseudomonas中含有的功能种类最多，在LA组样品中Pseudomonas主要含有acr3、AS3MT、arsBCHJR和aoxA，在HA组样品中Pseudomonas主要含有arsH、arsJ、arsR、aoxB和gapdh。LA组中acr3、arsA、arsC1和arsH主要来自Hydrogenophaga和Stutzerimonas。arsB主要分布于Rhodopseudomonas和Massilia。HA组中arsR、acr3、arsC和arsJ主要来自Thiothrix和Hydrogenophaga，LA组中含有砷功能基因的微生物种类多于HA组，这一发现与Cai等[64]的研究结果一致。
图5砷代谢基因的物种贡献关系
Fig.5Species contribution relationships for arsenic metabolism genes
综上所述，砷污染构成了一种进化驱动力，可以视为一种自然筛选机制，促进了耐受恶劣条件的微生物种群增长，并进化出具有砷代谢潜能的微生物。这些微生物通过氧化还原、代谢转化等机制应对砷毒性，在高砷环境中占据优势[24]。
2.4 环境因子对微生物砷代谢的影响
通过VIF方差膨胀因子分析，从表1中筛选出VIF值小于10的环境因子：pH、Deep、As、SO2-4、Fe和PO3-4。再通过db-RDA分析不同环境因子对砷代谢基因的相对影响大小，如图6所示，在这些环境因子中，PO3-4是与砷代谢基因相对影响最大的因子，其次是As、SO2-4、Deep、pH、Fe。有研究发现，磷酸盐水平的变化可以直接影响砷在细胞内的吸收、转运和代谢，提高培养液中的磷酸盐浓度可以降低细胞对As（Ⅴ）的吸收，并减少其在细胞内的积累[65]。且砷酸根离子（AsO3-4）与PO3-4具有相似的化学结构和电荷状态，这使得微生物的代谢途径难以区分这两种离子。这种相似性导致AsO3-4可以通过PO3-4的转运蛋白进入细胞，从而被误吸收到细胞内[66]。研究表明，PO3-4转运蛋白不仅负责磷酸盐的吸收，还可以运输AsO3-4[67]。研究发现，提高PO3-4浓度可以降低砷的毒性，因为PO3-4可以与砷竞争相同的转运蛋白，从而减少砷的吸收[68]。这些结果表明PO3-4浓度水平在调控砷代谢方面确实具有一定作用。
图6基于KEGG水平下的db-RDA分析
Fig.6db-RDA analysis based on KEGG levels
从图6可知，砷浓度与Deep和PO3-4呈负相关，地下水的砷浓度受还原条件的影响显著。在较深的地下水层中，由于与氧气的隔离时间较长，可能形成厌氧环境，这种环境有利于SO2-4等氧化物的还原。SO2-4的还原会固定砷，形成砷硫沉淀，从而降低地下水中砷浓度。SO2-4与Deep呈负相关也说明了这一点。李晓红等[69]在河南省杞县也得到了同样的结论。而砷浓度与PO3-4呈负相关，是因为PO3-4可以通过离子交换作用置换土壤或水体中的砷酸盐，从而降低砷的浓度[70]。砷浓度与pH、Fe、SO2-4呈正相关，且HA组样本在这4个环境因子上的投影距离均大于LA组样本，说明这4个环境因子对HA组样本的砷代谢基因影响更大。
为探究环境因子与砷代谢物种和砷代谢基因之间的相关性，进一步采用相关性热图分析，结果如图7所示。Nitrosomonas （亚硝化单胞菌属）、Thiobacillus（硫杆菌属）、Sulfuritalea丰度与As浓度呈显著正相关关系，Novosphingobium、Sphingomonas丰度与As浓度呈显著负相关关系。Thiobacillus是一类能氧化无机硫化物的细菌，包括多种能氧化硫、硫化物或硫代硫酸盐的菌种。从图2b可知，该菌在HA组样本中丰度较高，从图5可知该菌属的acr3、arsR、arsC、aoxB在HA组中贡献度较高，它可以通过ars操纵子（Arsenic-resistance operon）来编码抗砷相关的蛋白质，ArsC可以将砷酸盐还原为毒性较低的亚砷酸盐，Acr3则可以将As（Ⅲ）外排，这有助于它们适应复杂的含砷极端环境。
图7（a）地下水样品环境因子与属水平主要微生物的相关性热图（选取丰度位列前20的属进行分析）； （b）地下水样品环境因子和主要砷代谢基因的相关性热图（左侧和上侧分别是物种和环境因子的聚类树） （*0.01＜P≤0.05，**0.001＜P≤0.01，***P≤0.001）
Fig.7(a) Correlation heat map of major microorganisms at the environmental factor and genus level for groundwater samples; (b) Correlation heat map of environmental factors and major arsenic metabolism genes in groundwater samples
研究表明，Sulfuritalea可以通过砷酸盐呼吸来生长，使用砷酸盐（As（V））作为电子受体来进行能量代谢，同时生成了几乎等量的砷化物（As（Ⅲ））[71]。研究发现，Thiobacillus在砷污染环境中具有参与砷氧化依赖生物固氮的代谢潜力[72]，这说明该菌属在砷代谢中具有一定潜在作用。Thiobacillus参与氮循环，当参与氮循环的微生物与其他能够进行砷代谢的微生物共存时，它们之间的相互作用会影响各自的代谢活动，这是因为氮循环和砷循环在某些条件下可能共享相同的底物或电子受体，从而导致竞争或协同效应[73]。研究发现，某些能够进行生物固氮（biological nitrogen fixation，BNF）的细菌依赖于砷的存在或对其具有耐受性[72，74]。这说明，微生物在固氮时，可能同时参与到砷的代谢过程中，从而改变环境中砷的价态和浓度。Novosphingobium、Sphingomonas的砷代谢功能基因只在LA组中存在，说明这两种菌属均不是耐砷物种。
从图7b可知，砷浓度与arsC1和arsH呈显著负相关关系，这两种基因在LA组中的贡献更大（图5）。这种负相关可能是因为低砷环境中的主要贡献菌属（Hydrogenophaga、Stutzerimonas）在高砷环境中的丰度显著下降，从而导致基因表达下降。砷浓度与AS3MT呈显著正相关关系，说明该流域高砷环境下的微生物主要通过砷甲基化途径来降低砷毒性和代谢砷。综上所述，砷代谢物种和基因还与多个环境因子有显著相关性，说明砷代谢微生物群落组成和功能基因通常受到多重环境因子影响，而不是只受砷浓度的调控。
3 结论
1）研究区地下水的优势菌门为Proteobacteria、Actinobacteria、Planctomycetota。在属水平上，LA组样品的砷代谢微生物群落组成展现出显著的物种丰富度优势。Nitrosomonas、Thiobacillus、Sulfuritalea与砷浓度呈显著正相关关系。Novosphingobium、Sphingomonas与砷浓度呈显著负相关关系。这说明砷具有选择压力，可以改变微生物群落组成，使具有砷抗性的微生物在高砷环境中富集。
2）本研究共注释到砷代谢相关的功能基因主要有12种，分别为：砷甲基化功能基因AS3MT、gapgh，As（Ⅲ）氧化功能基因aoxB、aoxA和arsH，As（V）还原功能基因arsC，砷运输功能基因arsA、acr3、arsJ和arsB，以及转录调控因子arsR。砷浓度与arsC1和arsH呈显著负相关关系，砷浓度与AS3MT呈显著正相关关系，说明该流域高砷环境下微生物主要以砷甲基化途径来代谢砷。
3）PO3-4和砷浓度与砷代谢基因的相关性较强。As、pH、Fe和SO2-4对HA组样本的砷代谢基因影响更大。砷代谢微生物群落和功能基因与砷浓度之间的关系受到多种环境因素的调控和影响，而不是受单因子调控。
基于宏基因组学研究方法，本研究系统解析了奎屯河流域地下水中砷代谢微生物的群落结构特征和功能基因组成，从分子水平揭示了砷在生物体内的转化机制。为了更全面地阐释功能基因的表达，建议后续研究整合宏转录组学和宏蛋白质组学等多组学技术进行深入研究。
