2015, Vol. 27 
(2: 中国环境科学研究院湖泊生态环境创新基地，北京 100012)
(3: 中国科学院水生生物研究所，武汉 430072)
(2: Research Center of Lake Environment, Chinese Research Academy of Environmental Science, Beijing 100012, P.R.China)
(3: Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, P.R.China)
富营养化目前是很多国家面临的一个持久的环境难题，主要是人口增长、人类活动加快和污染排放增加等带来的影响.由于这些区域氮、磷的增加，湖泊生态系统面临越来越大的压力[1-2].随着富营养化的发展，湖泊生态系统将会出现生物多样性下降、生物群落结构单一化、水体质量下降等问题[3-5].人为氮输入对水生生态系统造成不利影响，需要找到合适的指标来评价水质的变化[6].而稳定同位素技术在环境领域中被认为是很好的天然示踪剂，在污染物迁移和转化过程中组成稳定，不造成二次污染，因此被广泛应用[7].
初级生产者的δ15N来指示氮的来源和氮污染负荷已经不是一个新的技术.海草、红树林、藻类等植物的δ15N都已经被用来评价废水输入对生态系统的影响[6, 8-9].氮有两种稳定同位素14N和15N，相对丰度14N=99.64 %，15N=0.36 %.水生生态系统中氮的来源包括降水、化肥、动物粪便、污水排放、地下水和微生物的氮循环等，这些来源有不同的δ15N.例如化肥的δ15N为-3‰~3‰，污水或者动物粪便的δ15N为10‰~22‰，大气中的δ15N为2‰~8‰[10-11].随着时间的推移，初级生产者将依据他们的增长整合利用这些营养物质，反映出一定的同位素特征[8].水生植物氮同位素已经被证实是一种很好的指示剂，可以用来指示人为氮的输入[12].水生植物会吸收水中的溶解性无机氮(DIN)(包括硝态氮(NO3--N)和铵态氮(NH4+-N))，在吸收和同化过程具有较大的同位素效应，被吸收、同化后的氮素比吸收同化前更富集15N.硝化、反硝化、挥发过程均会产生比较大的同位素分馏[10].一些研究表明初级生产者的δ15N随污水中DIN的增加而增加[13]，污染区域发现的植物δ15N比未污染区域植物δ15N高[4, 14].
太湖流域有172条河流连通着太湖[15]，大多数污染物流入的河流位于西部或西北部，而污染物流出的河流位于南部或东南部，大约有30 % ~40 %的氮、磷被留在湖中[3].氮、磷和其他一些元素是植物生长所必需的，如果水体收到更多不必要的氮和磷，生态系统稳定性将改变，例如发生蓝藻水华.而外源物质的输入是造成太湖富营养化的主要原因[16].本研究利用同位素技术，探讨水生植物δ15N与水体环境因子之间的关系，进而评定水生植物δ15N可以作为湖泊输入负荷的指示器，为太湖外源负荷的监测提供一种有效且简单的方法，同时为太湖流域生态评价提供依据.
1 材料与方法 1.1 研究区概况太湖是我国第三大淡水湖，位于长江的下游，跨江苏无锡、苏州和浙江湖州等城市(30°55′40″~31°32′58″N，119°52′32″~120°36′10″E).湖泊面积2338 km2，湖长(从北到南) 68.5 km，湖宽(从东到西)56 km.平均水深1.9 m，最大深度2.6 m[3].
重污染的湖荡主要集中在太湖流域西北部，即无锡、宜兴、苏州辖区，污染较轻的湖荡主要集中在太湖流域东南部，即湖州辖区[17].近10年来，由于城市化加快、水体高密度养殖和污染物排放增加，太湖夏季蓝藻水华频繁暴发，湖荡水体生态严重退化，水生生物多样性全面衰退.
1.2 样品采集与处理在太湖以及太湖周边湖荡布置采样点(图 1)，用采水器在水表层0~0.5 m采集水样.采集的水样在冷藏条件下运回实验室，通过GF/C玻璃纤维滤膜(47 mm)过滤后的滤液转移到250 ml瓶子中，滤膜用于叶绿素和悬浮物的测定，滤液用于测定其他水化指标.载有悬浮物的滤膜经过105℃烘干后，用电子天平称量悬浮物(SS)的质量，该值与水样体积的比值即为悬浮物的浓度.叶绿素a(Chl.a)采用丙酮萃取分光光度法测定；高锰酸盐指数(CODMn)采用高锰酸盐指数法测定；总氮(TN)采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法测定；NH4+-N采用纳氏试剂比色法测定；总磷(TP)采用过硫酸钾消解钼酸铵分光光度法测定；正磷酸盐(PO43-)采用钼酸铵分光光度法测定[18].
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图 1 太湖地区采样点分布 Fig.1 Location of sampling sites in Lake Taihu regions |
水生植物样品用采草器在水样采样点的周围采集，采集的植物种类包括挺水植物、沉水植物、浮叶植物、自由漂浮植物.采集的每株植物取其最新叶片放入塑料袋，带回实验室处理.将其表面附着藻刮洗后，用去离子水反复冲洗3次，在60℃下烘干48 h至恒重，用研钵研磨成均匀粉末后放入细菌保存管中保存.
1.3 稳定同位素分析植物样品分析所用的仪器为中国科学院水生生物研究所Carlo Erba EA-1110元素分析仪与Delta Plus Finnigan同位素比率质谱连用仪.氮同位素比值以δ值的形式表达：δ15N=[(Rsample/Rstandard)-1]×1000.式中，Rsample为所测得的同位素比值，氮同位素是14N/15N；Rstandard为标准物质的同位素比值，氮稳定同位素测定的标准物质为N2.δ值越小表示样品重同位素15N含量越低，越大表示样品重同位素15N含量越高.每测定10个样品插入1个标准样品，并随机挑选1~2个样品复测.样品分析精度为±0.3‰[19].
1.4 数据处理如果数据不符合正态分布，选择数据转换也未能实现正态分布，则使用Kruskal-Wallis检验(秩和检验)差异显著性，样本间的多重比较则使用Kruskalmc检验.如果数据符合正态分布，则使用t检验来检验差异显著性.
由于水生植物δ15N与水体环境因子之间的关系复杂，不能用多元线性回归解释它们之间的相互关系，所以用广义可加模型GAM来探讨.GAM为广义线性模型的非参数化扩展，其优点是能直接处理响应变量与多个解释变量之间的非线性关系.广义可加模型在拟合响应变量与解释变量之间的非线性关系过程中，需考虑曲线的拟合优度和光滑度，还要避免或者减轻过度拟合.根据GAM中得出的各解释变量的显著程度(P值)和赤池信息量基准(AIC值)来对模型变量进行选择，筛选出最优的解释变量.
本研究中，δ15N为响应变量，并且进行对数转换，以太湖和太湖湖荡水体各个因子SS、CODMn、NH4+-N、TN、TP、PO43-、Chl.a为解释变量，采样时间(time)作为随机变量加入到模型中，建立GAM模型：
| $ \begin{array}{l} {\rm{Log(}}{{\rm{ \mathsf{ δ} }}^{{\rm{15}}}}{\rm{N) = }}s\left( {{\rm{SS}}} \right){\rm{ + }}s\left( {{\rm{TN}}} \right){\rm{ + }}s{\rm{(NH}}_4^ + {\rm{ - N) + }}\\ s\left( {{\rm{TP}}} \right){\rm{ + }}s{\rm{(PO}}_4^{3 - }{\rm{) + }}s{\rm{(CO}}{{\rm{D}}_{{\rm{Mn}}}}{\rm{) + }}s\left( {{\rm{Chl}}{\rm{.a}}} \right){\rm{ + }}s\left( {{\rm{time}}} \right){\rm{ + }}\varepsilon \end{array} $ | (1) |
式中，s为自然样条平滑，ε为误差项.AIC值越小，表明模型的拟合效果越佳，利用P值判定各因子的显著性是否存在差异.
2 结果 2.1 稳定同位素分析结果太湖水生植物的δ15N组成在3.5‰~25‰之间变化，其中水鳖的δ15N值最大(16.59‰±4.18‰)，金银莲花的δ15N值最小(7.29‰±0.95‰).采集到的植物中，分布较多的植物种类为沉水植物，有竹叶眼子菜、菹草、穗花狐尾藻、金鱼藻等，自由漂浮植物较少，仅有少量的水鳖和槐叶苹.挺水植物主要有芦苇、菰、空心莲子草(表 1).不同生活型的δ15N值没有显著性差异(P＞0.05)，黑藻的δ15N值和其他水生植物之间没有显著性差异(P＞0.05).
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表 1 太湖采集植物δ15N值的概括统计* Tab.1 Summary statistics of δ15N values for the macrophytes collected in Lake Taihu |
由图 2可知，太湖各个月份水生植物δ15N值之间有显著差异性(Kruskal检验，P＜0.05).6月份水生植物的δ15N平均值最高，而11月份δ15N最小.11月和6月水生植物的δ15N有显著差异(P＜0.05)，其余月份之间的δ15N没有显著差异(P＞0.05).按照北半球平均气温将太湖地区的四季做如下划分：11月下旬至次年2月底为冬季；3月上旬至5月中旬为春季；5月底至9月上旬为夏季；9月中旬至11月中旬为秋季[20].结果表明季节之间的δ15N没有显著变化(Kruskal检验，P=0.334).
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图 2 太湖水生植物样品稳定氮同位素比值随取样时间的月变化趋势 Fig.2 Monthly trend of stable nitrogen isotope ratios in aquatic plant samples from Lake Taihu through the sampling time |
GAM模型结果表明，有5个因子进入模型，模型的总解释率为25.8 %，R2为0.236.其中δ15N与PO43-相关性极显著(P值远远小于0.001)，TN、Chl.a、TP、NH4+-N与δ15N显著相关(P＜0.05).由图 3所示，PO43-与水生植物δ15N存在非线性关系，对δ15N影响最大，δ15N随着PO43-浓度的增大而增大.PO43-浓度在0.015~0.025 mg/L时，δ15N值下降，大于0.025 mg/L时，δ15N值单调递增. TN浓度小于2.5 mg/L时，对于δ15N值影响不大，大于2.5 mg/L时，δ15N值单调递减.NH4+-N浓度和水生植物δ15N存在显著的正相关，且为线性关系.TP、Chl.a对于δ15N值变化影响较小.
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图 3 水生植物δ15N与水体环境因子GAM分析(实线表示氮同位素与各因子关系的加性函数，虚线表示拟合加性函数逐点的标准差) Fig.3 Relationship between aquatic plants nitrogen isotopic signatures and its environmental parameters in water column from GAM |
研究结果表明，不同生活型的水生植物δ15N没有显著差异，可能是由于采集的都是水里的新叶，在吸收同化过程中都发挥了等同的同位素效应.Madsen 等[21]发现沉水植物去掉根部后，叶子也可以对水中营养物进行吸收，并且叶子对水体中营养物的吸收能力强于沉积物[22].已有研究表明，黑藻具有典型的C4型光合作用途径[23]，但是其δ15N值与其他C3途径植物比较没有显著性差异，也说明了水生植物氮同位素不受其生活型和光合反应途径的影响.
本研究中水生植物δ15N与水体中的NH4+呈线性正相关关系.水生植物会吸收水体中的DIN(NH4+-N和NO3--N)，NH4+-N吸收相比于NO3--N吸收能降低能量消耗，因此NH4+-N成为许多初级生产者的最优先氮源[24].水生植物对NO3-、NH4+等无机盐的吸收和同化过程具有较大的同位素效应.氨挥发过程能产生15N贫化的NH3，使剩余的NH4+-N富集15N.硝化过程同样使剩余的NH4+-N富集15N，植物吸收这些富集的15N导致高的δ15N.这一结论只适用水体中NH4+-N浓度较低时，本研究中NH4+-N浓度为0~2 mg/L，但当NH4+-N浓度较高时，植物δ15N的变化可能相反.Cole等[13]发现随着地理位置改变，一些植物δ15N伴随着水体中DIN浓度增加而增加.所以本研究中水生植物δ15N的变化规律能很好地指示水体中人为氮输入的变化.
水体中TN的浓度与δ15N呈负相关.可能有以下几个原因：(1)氮源发生变化，不同来源的δ15N不同，污水或者动物粪便的δ15N为10‰~22‰，化肥污水的δ15N为-3‰~3‰，同化过程中的分馏程度随氮的来源变化[25].吸收氮源中重的15N导致水生植物δ15N值偏高，吸收贫化的15N导致水生植物δ15N偏低；(2)随着TN浓度的升高，氮的可用性超过了氮的需求，不是所有可利用的氮都能被植物吸收，氮的吸收则会更倾向14N而不是15N，15N分馏从而导致水生植物δ15N值减小.湿生植物[26]、浮游植物[27]、水生植物和红树林[28-29]植物叶子的δ15N与氮的有效性和植物对氮的需求之间的关系已经被研究，结果都表明植物的氮同位素特征与氮的可用性和植物对氮的需求有关.
水生植物的δ15N随着PO43-浓度增加，总体上呈现上升的趋势.外部P可用性的变化已经被证实会影响红树林的δ15N[26]，这一理论同样适用于水生植物[30-31].磷浓度较低时水生植物有较低的δ15N.沉积物中的磷释放造成水体中无机磷浓度很高[32]，此时氮是主要的限制因子.磷的浓度增加，导致植物对氮的需求变大并且减少了15N的分馏，所有的氮同位素都能够被吸收，因此植物的δ15N很高.
有研究表明，2000-2007年相对于无锡地区，吴江地区城镇建设用地较少[33]，而城镇建设用地对水质指标(溶解氧、CODMn和NH4+-N)有负面影响[34].无锡区域重富营养化的湖荡就占有26.7 %，而苏州、湖州、常进地区只存在中富营养和富营养湖荡.在无锡地区湖荡采集植物样品数量n=52，吴江地区为n=28，对两个地区的水生植物δ15N值进行比较，结果表明有显著性差异(t检验，P＜0.05)，无锡地区湖荡水生植物的δ15N值较吴江地区湖荡的高.Fry等[29]发现红树林叶子的δ15N值在受人为影响较大的红树林与受人为影响较小的氮输入区之间有显著的差异性，前者δ15N值较高，后者则较低.这些研究都说明了水生植物能够很好地指示外源输入对水生生态系统的影响.
4 结论本研究结果表明，水生植物氮同位素值不受生活型和光合反应途径的影响，主要与氮的有效性和植物对氮的需求有关[35-36].利用水生植物δ15N值作为指示器可以成功地评估人为氮输入对水生生态系统的影响，这个研究结果提供了一个简单的工具去评价外源营养物质输入对湖泊生态系统的影响，而不是用传统的监测水体营养物质的方法，为评价太湖流域水环境提供理论依据.
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