2015, Vol. 27 
裸腹溞属(Moina)是枝角类的重要类群, 通称水蚤.本属的描述种类有几十种, 我国记载的有十种, 存在同物异名现象[1-2].早期的枝角类种类鉴定主要依据其形态特征, 由于枝角类种类的分类特征有限以及形态变异十分丰富, 加上近源个体之间可以杂交[3], 至今只有40 % ~50 %的种类被准确描述, 部分种类分类比较含糊, 其中一些种类可能以种复合体的形式存在[4].随着分子生物学技术的进步, 利用基因标记对枝角类进行分子系统学研究已逐渐成为趋势, Petrusek等以线粒体12S rRNA基因作为分子标记验证了微型裸腹溞在两个大陆间(欧洲中部和澳大利亚)的种类不统一[5]; Prosser等用不同引物在不同条件下进行对照, 扩增了包括微型裸腹溞在内的不同小型甲壳动物的线粒体COI基因[6], 但没有进行系统分化方面的分析.国内学者对薄皮溞属(Leptodora)、西藏拟溞(Daphniopsis tibetana)、拟同形溞(Daphnia similoides)的系统分类进行了研究[7-9], 有关裸腹溞属系统分化的研究尚未见报道.本研究通过对安徽巢湖、江苏太湖、洪泽湖、淮北乾隆湖4个湖泊中已发现的短型裸腹溞、发头裸腹溞和微型裸腹溞的16S rDNA序列进行分析, 通过与GenBank上下载的与本研究序列相似度最大的裸腹溞属种类的16S rDNA进行比对, 探讨他们之间的分子系统关系, 提出了一些与传统分类上不一致的问题, 以期为裸腹溞属的遗传多样性和物种归属问题提供基础资料.
1 材料与方法 1.1 实验材料研究用巢湖的短型裸腹溞、发头裸腹溞和微型裸腹溞来自2012年3月巢湖及其支流(南淝河)沉积物中休眠卵的孵化, 并分离鉴定[2, 10](表 1); 洪泽湖发头裸腹溞于2013年6月采集于洪泽湖; 太湖微型裸腹溞于2013年5月采自太湖; 乾隆湖短型裸腹溞于2014年5月采自淮北乾隆湖.几种裸腹溞种类均在智能光照培养箱中用斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)培养, 培养温度为25℃±1℃、光照时间L:D=12h:12h.实验时用吸管吸取单只个体饥饿一昼夜后用双蒸水冲洗, 离心管收集备用.
|
表 1 本研究中样本核苷酸序列的来源及编号 Tab.1 The origin and number of nucleotide sequence of samples in this study |
采用微量样品基因组DNA试剂盒(TIANamp Micro DNA Kit)提取裸腹溞属DNA.由于裸腹溞属种类属于小型甲壳动物, 外被甲壳, 在提取前用灭菌的牙签捣碎溞体, 有利于蛋白酶K对组织进行消化.
1.3 PCR扩增及序列测定用于扩增16S rDNA基因引物[11]:
| $ \begin{array}{l} {\rm{L}}2510\;5'\;{\rm{to}}\;3'\left( {{\rm{CGCCTGTTTAACAAAAACAT}}} \right)\\ {\rm{H}}3059\;5'\;{\rm{to}}\;3'\left( {{\rm{CCGGTCTGAACTCAGATCATGT}}} \right) \end{array} $ |
PCR反应体系25μl, 每个反应体系内含10×LA-Taq BufferⅡ 2.5μl、dNTP(2.5 mol)4.0μl、Mg离子(2.5 mol)0.5μl、模板DNA(100 ng/μl左右)1.0μl、Taq酶(5U/μl)0.25μl、上下游引物各(10μm)1.0 μl, 双蒸水补足到25μl.
扩增条件为95℃预变性3min, 95℃变性45s, 50℃退火45s, 72℃延伸45s, 共35个循环, 72℃ 10min充分延伸, 4℃结束.
扩增产物经电泳检测后, 选择目的带清晰且明亮的PCR反应产物送交生工生物工程公司(上海)纯化并测序.所有样品均采用双向测序, 正反向对比后确定分析用序列, 用DNAStar中的SeqMan比对, 并对比峰图修除两端不可靠的碱基, 经人工校正后获得CDL有效碱基417个, CFL有效碱基411个, CWL有效碱基417个, HFL有效碱基381个, TWL有效碱基406个, QDL有效碱基491个.其它从GenBank上下载的用于分析的序列见表 1.
1.4 系统发生分析用DNAStar对测序结果进行人工校正, 并去除两端冗余序列.使用DNAStar软件比较序列差异百分比; 用Clustalx 1.81软件多重序列比对; 用DNAspV5分析变异位点; 用Mega 4.1计算不同序列间转换/颠换数, 生成序列差异位点表, 并计算遗传距离和构建NJ进化树.采用K2P双参模型计算两两遗传距离, 系统树设置采用P-distance模型, 以大型溞(Daphnia magna)为外群, Bootstrap Replications1000次; 用Mrbayes 3.2构建贝叶斯树, 替换模型设置参数nst=6(GTR模型), 位点速率变异设置invgamma, 其余设置为默认值; 采用mcmc法运算500000代, 每100代取样一次, 在舍弃25 %老化样本后, 用剩余样本构建一致树.
2 结果CDL、QDL、CFL、CWL、HFL、TWL在DNAStar中经过两两序列比对, TWL与CWL相似度为100 %, HFL与CFL相似度为99 %, 有两个位置发生转换; CDL与QDL相似度为99 %, 有一个位置发生转换, 另一个位置发生颠换.碱基中A+T含量(67.6 %)明显高于G+C含量(32.4 %); 3个物种间平均种间相似度为88.7 %, 用DNAsp v5进行序列变异位点分析, 上述6个裸腹溞属个体可识别位点(包括缺失与丢失的位点)381个, 其中保守位点313个, 变异位点68个, 单一位点3个, 简约信息点65个; 用MEGA软件分析平均转换/颠换(si/sv)数为0.78, 颠换数明显高于转换数.与来自GenBank上Moina的16S rDNA进行序列比对, 计算遗传距离见表3; 就构建的NJ树(图 1a)和贝叶斯树(图 1b)来看, 两者主要分枝基本一致.
|
图 1 基于9个裸腹溞属个体16S rDNA序列构建的系统发生树(NJ树)(a)和贝叶斯树(b) Fig.1 NJ tree(a) and Bayes tree(b) based on the sequence of 16S rDNA in nine Moina individuals |
线粒体rRNA基因是非编码蛋白质的基因, 进化过程中未受到密码子编码的选择压力影响, 进化速率相对较低且比较保守[12].本研究所测3个裸腹溞属种类的个体中, 种间的16S rDNA序列相似度百分比在87 % ~90 %之间(表 2), 这与臂尾轮虫属的种间序列相似度较一致[13].从已测出的3种裸腹溞的16S rDNA部分碱基序列比对表可以看出, 3个裸腹溞属种类的变异区相对比较集中, 以序列最短的洪泽湖发头裸腹溞序列作为基准定位, 在第1位到第163位碱基之间仅有12处发生碱基的改变, 而从164到282之间却有51处发生变异; 碱基中A+T(67.6 %)与Petrusek等研究的多刺裸腹溞和微型裸腹溞12S rRNA基因的A+T含量(69.4 % ~72.5 %)接近[5], 较高的A+T含量是无脊椎动物线粒体DNA中的普遍现象[14-16].
|
|
表 2 9个裸腹溞属个体16S rDNA的遗传距离(对角线下)和序列相似度(对角线上) Tab.2 The genetic distances(below diagonal) and sequence similarity(above diagonal) of 16S rDNA in nine Moina individuals |
经过DNAStar序列比对, CFL与HFL的16S rDNA序列相似度为99 %, 遗传距离(K2P双参模型, 下同)为0.5 %, 这可能是地理隔离造成的种内遗传差异.而CFL和HFL的16S rDNA序列与从GenBank下载的NCL的遗传距离也较小(0.5 % ~1.1 %), 远低于枝角类线粒体序列种内差异上限5 %的分歧度[17].NJ树(P-distance模型)也支持NCL与CFL和HFL聚为一类.因此, 就16S rDNA分析看, 我国的CFL和HFL应与来自欧洲的NCL为同一个物种.通过查阅文献发现[18-21], 发头裸腹溞这一名称仅限国内学者使用, 国外学者较少使用, 而Goulden把发头裸腹溞归到M.affinis一类[22].本研究的发头裸腹溞雌性体长一般大于1.00 mm, 孵育囊饱满时, 壳高常大于壳长.头部膨大, 背侧丛生刚毛, 无眼上凹, 卵鞍长卵形, 内储2个冬卵.后腹部宽大, 各侧有10个羽状肛刺.这与《中国动物志·淡水枝角类》[2]中对发头裸腹溞的描述一致.通过形态观察发现, 本研究的发头裸腹溞在肛刺数量、卵鞍形状及卵鞍内冬卵的数量等方面与M.affinis存在较大的区别, 与多刺裸腹溞的卵鞍形状、卵鞍内冬卵的数量也不同[2, 22].Elmoor-Loureiro等报道了一种新发现的多刺裸腹溞, 其外形、卵鞍特征和冬卵数量与本研究的发头裸腹溞相似[23].结合16S rDNA序列的分析结果, 推测本研究的发头裸腹溞应为多刺裸腹溞.由于缺乏更多的形态和分子对比资料, 有关国内发头裸腹溞的归属问题仍需进一步的探讨.
本研究的微型裸腹溞雌性体长在0.65~0.83mm之间, 复眼很大, 位于头顶; 头部很大, 背侧有较深的眼上凹; 后腹部短, 侧面有羽状肛刺6个, 叉状肛刺1个; 卵鞍近乎卵圆型, 内储冬卵1个.这些形态特征与《中国动物志.淡水枝角类》[2]中关于微型裸腹溞的描述较一致.来自巢湖与太湖的微型裸溞相似度为100 %, 但在NCBI的BLAST中未找到与之相似度较高的物种, 只有M.brachiata(JN651425)与之有92 %的相似度; 在GenBank中也没有找到微型裸腹溞16S rDNA序列的数据与本研究进行比对.因此, 关于微型裸腹溞的分子系统学仍需做更多的研究.
本研究的短型裸腹溞雌性体长1.00~1.50mm, 浅青灰色, 壳瓣背缘均匀弓起, 头部无毛发, 长度超过壳长的一半, 向下倾斜, 背侧有大而深的眼上凹, 后腹部较长, 各侧有羽状肛刺8个, 叉状肛刺一个, 这与《中国动物志·淡水枝角类》[2]中的短型裸腹溞描述较一致.卵鞍内储冬卵一个, 这与文献[22]中对短型裸腹溞的描述一致.本研究中, 巢湖(CDL)和淮北乾隆湖(QDL)的短型裸腹溞相似度为99 %, 遗传距离为0.5 %.他们与GenBank下载的欧洲短型裸腹溞(NDL1、NDL2)的相似度相对较小(88 % ~90 %), 遗传距离(13.2 % ~13.5 %)较大.其遗传距离远远大于枝角类小于5 %的种内范围[17], 达到端足类钩虾属的种间分化水平[24].就NJ树和贝叶斯树分析, CDL、QDL与下载的欧洲短型裸腹溞(NDL1和NDL2)的分枝较远, 也已经不在一个种的界限内.造成这种差距的原因可能有两点:一是长期远距离的地理隔离, 不同环境发生的自然选择不同导致遗传上的较大差异; 二是存在形态相似而基因有差别的物种或称隐种[25], 这种现象已经发生在微型裸腹溞的跨洲(欧洲中部和澳大利亚)分化上[5].圆形盘肠溞曾被看作是枝角类中一个分布较广、生活习性多样化的种, 但后来发现它实际上是以一种复合体的形式存在[26-27].其他广泛分布的短钝溞(D.obtusa)、长额象鼻溞(Bosmina longirostris)也依然存在分类上的误区[4].关于枝角类物种的统一性问题一直受到质疑[28-29].近年来, 随着分子工具的使用, 大量的形态结构和分子研究都证明了非统一性物种的存在, 这将会改变我们对枝角类的发展史、生物地理学和物种多样性的认识[30-33].
| [1] |
赵文. 水生生物学. 北京: 中国农业大学出版社, 2005, 181-185.
|
| [2] |
蒋燮治, 堵南山. 中国动物志·淡水枝角类. 北京: 科学出版社, 1979, 1-160.
|
| [3] |
Billiones R, Brehm M, Klee J et al. Genetic identification of Hyalodaphnia species and interspecific hybrids. Hydrobiologia, 2004, 526: 43-53. DOI:10.1023/B:HYDR.0000041615.65087.06 |
| [4] |
Korovchinsky NM. How many species of Cladocera are there?. Hydrobiologia, 19996, 321: 191-204. |
| [5] |
Petrusek A, Cerny M, Audenaert E. Large intercontinental differentiation of Moina micrura(Crustacea:Anomopoda):one less cosmopolitan cladoceran?. Hydrobiologia,, 2004, 526: 73-81. DOI:10.1023/B:HYDR.0000041612.08425.f0 |
| [6] |
Prosser S, Martinez-Arce A, Elias-Gutierrez M. A new set of primers for COI amplification from freshwater microcrustaceans. Molecular Ecology Resources, 2013, 13(6): 1151-1155. |
| [7] |
Xu L, Han BP, Damme KV et al. Biogeography and evolution of the Holarctic zooplankton genus Leptodora(Crustacea:Branchiopoda:Haplopoda). Journal of Biogeography, 2011, 38: 359-370. DOI:10.1111/jbi.2011.38.issue-2 |
| [8] |
赵文, 李睿. 4个品系西藏拟溞12S rRNA基因序列及其分子进化研究. 大连海洋大学学报, 2012, 27(4): 300-305. |
| [9] |
顾杨亮, 徐磊, 林秋奇等. 新亚种—中华拟同形溞(Daphnia similoides sinensis). 生态科学, 2013, 32(3): 308-312. |
| [10] |
Deng DG, Xie P, Zhou Q et al. Field and experimental studies on the combined impacts of cyanobacterial blooms and small algae on crustacean zooplankton in a large, eutrophic subtropical Chinese lake. Limnology, 2008, 9: 1-11. DOI:10.1007/s10201-007-0229-x |
| [11] |
Bouchon D, Souty-Grosset C, Raimond R. Mitochondrial DNA variation and markers of species identity in two penaeid shrimp species:Penaeus monodon Fabricius and P.japonicus Bate. Aquaculture, 1994, 127(2): 131-144. |
| [12] |
窦红霞, 张彤晴, 许志强等. 长臂虾亚科9个种系统发育关系的16S rDNA序列分析. 淡水渔业, 2008, 38(1): 40-43. |
| [13] |
程双怀, 席贻龙. 基于16S rDNA基因序列探讨十种臂尾轮虫的系统关系和分类地位. 动物分类学报, 2009, 34(4): 934-940. |
| [14] |
Anderson FE. Phylogeny and historical biogeography of the loliginid squids(Mollusca:Cephalopoda) based on mitochondrial DNA sequence data. Molecular Phylogenetics and Evolution, 2000, 15(2): 191-214. DOI:10.1006/mpev.1999.0753 |
| [15] |
高天翔, 张秀梅, 吉崎悟朗等. 日本绒螯蟹线粒体DNA序列研究I.12S rRNA. 青岛海洋大学学报, 2000, 30(1): 43-47. |
| [16] |
刘君, 李琪, 孔令锋等. 基于线粒体COI的DNA条形码技术在贻贝科种类鉴定中的应用. 水生生物学报, 2011, 35(5): 874-881. |
| [17] |
Adamowicz SJ, Petrusek A, Colbourne JK et al. The scale of divergence:a phylogenetic appraisal of intercontinental allopatric speciation in a passively dispersed freshwater zooplankton genus. Molecular Phylogenetics and Evolution, 2009, 50(3): 423-436. DOI:10.1016/j.ympev.2008.11.026 |
| [18] |
郑又雄. 发头裸腹溞卵和胚胎发育形态研究. 动物学杂志, 1993, 28(6): 5-8. |
| [19] |
高露娇, 赖伟, 陈立侨. 发头裸腹溞(Moina irrasa Brehm)种群增长与食物浓度及光照的关系. 水产科技情报, 1997, 24(2): 61-64. |
| [20] |
饶小珍, 许友勤, 陈寅山等. 发头裸腹溞—一种新的溞类毒性试验材料. 生物技术, 2000, 10(1): 17-19. |
| [21] |
陈丽娜, 李玉颖, 邓道贵等. 种群密度和培养体积对发头裸腹溞生长和繁殖的影响. 应用生态学报, 2012, 23(7): 1959-1964. |
| [22] |
Goulden CE. The systematics and evolution of the Moinidae. Transaction of American Philosopnical Society, 1968, 58(6): 15-41. |
| [23] |
Elmoor-Loureiro LMA, Santangelo JM, Lopes PM et al. A new report of Moina macrocopa(Straus, 1820)(Cladocera, Anomopoda) in South America. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 2010, 70(1): 225-226. DOI:10.1590/S1519-69842010000100031 |
| [24] |
Costa FO, de Waard J, Boutillier J et al. Biological identifications through DNA barcodes:the case of the Crustacea. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 2007, 64: 272-295. DOI:10.1139/f07-008 |
| [25] |
项贤领, 席贻龙, 温新利等. 萼花臂尾轮虫种复合体遗传分化的空间格局. 动物学研究, 2010, 3(31): 205-220. |
| [26] |
Frey DG. Questions concerning cosmopolitanism in Cladocera. Archiv für Hydrobiologia, 1982, 145: 5-17. |
| [27] |
Frey DG. The taxonomy and biogeography of the Cladocera. Hydrobiologia, 1987, 145: 19-28. DOI:10.1007/BF02530261 |
| [28] |
Dumont HJ, Negrea SV. Introduction to the class Branchiopoda. In: Dumont HJ ed. Guides to the identification of the microinvertebrates of the continental waters of the world 19. Leiden: Backhuys Publishers, 2002.
|
| [29] |
Frey DG. The taxonomic and phylogenetic significance of the head pores of the Chydoridae(Cladocera). Internationale Revue der gesamten Hydrobiologie, 1959, 44: 27-50. DOI:10.1002/(ISSN)1522-2632 |
| [30] |
Adamowicz SJ, Hebert PDN, Marinone MC. Species diversity and endemism in the Daphnia of Argentina:A genetic investigation. Zoological Journal of the Linnean Society, 2004, 140: 171-205. DOI:10.1111/j.1096-3642.2003.00089.x |
| [31] |
Cox AJ, Hebert PDN. Colonization, extinction, and phylogeographic patterning in a freshwater crustacean. Molecular Ecology, 2001, 10: 371-386. DOI:10.1046/j.1365-294x.2001.01188.x |
| [32] |
Schwenk KN, Posada D, Hebert PDN. Molecular systematics of European Hyalodaphnia:the role of contemporary hybridization in ancient species. Proceedings of the Royal Society of London, 2000, B267: 1833-1842. |
| [33] |
Taylor DJ, Ishikane CR, Haney RA. The systematics of Holarctic bosminids and a revision that reconciles molecular and morphological evolution. Limnology and Oceanography, 2002, 47: 1486-1495. DOI:10.4319/lo.2002.47.5.1486 |