2015, Vol. 27 
(2: 美国佛罗里达大学土壤和水科学系，佛罗里达州 32611)
(2: The Soil and Water Science Department, University of Florida, Florida 32611, USA)
湖光岩玛珥湖(21°09′N，110°17′E)是雷琼新生代火山区中一个典型的玛珥湖，位于中国广东省湛江市西南方约18km处(图 1)，属于热带季风气候区，年均气温23℃，其汇水面积为32km2，平均水深约为12m，最大深度约为22m[1].湖光岩玛珥湖是由平地火山爆发后冷却下沉形成的玛珥式火山湖，湖水的变化主要取决于降水和地下水，是一个典型的亚热带湖泊，也是世界上最大的玛珥湖，可作为研究玛珥湖现代生态学的理想场所.由于湖光岩玛珥湖是一个封闭式、面积小、结构简单的稳定的生态系统，自然环境独特，水体生态环境良好，浮游植物群落结构多样，通过浮游植物对溶解态氮的吸收转化作用完成湖泊氮素的生物循环和水质净化.
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图 1 湖光岩玛珥湖及采样点位置 Fig.1 Geographical location of the Huguangyan Maar Lake and coring site |
氮素的生物地球化学循环是整个生物圈物质循环的重要组成部分，在湖泊营养循环中占有重要地位[2].氮循环包括地球化学循环和生物循环，浮游植物是湖泊生态系统氮生物循环的主要承担者，也是生物地球化学循环的关键环节.有研究表明，湖泊生态系统中氮营养物主要通过微生物的作用去除[3]，而浮游植物的作用也是必不可少的，它们为好氧型微生物的硝化作用提供充足的氧气和良好的微生态环境，同时也直接吸收利用部分溶解态氮用于自身生长[4].浮游植物作为水域生态系统中的初级生产者，是整个水域生态系统中物质循环和能量流动的基础，其对水体营养状态的变化能迅速做出响应[5].溶解态氮是浮游植物吸收氮的主要形式，但不同形态氮的吸收特征因浮游植物群落组成和环境条件不同而存在差异[6].
浮游植物对溶解态氮的吸收，是湖泊生态系统氮循环的重要环节[7].国外对湖泊等水域生态系统浮游植物氮吸收的相关研究较多[8-10]，而国内的相关研究较少[7, 11-13].Gu等[9-10]利用15N同位素示踪技术，对美国Smith、Okeechobee等湖泊中浮游植物氮吸收开展了研究，揭示了浮游植物氮吸收的相关机理及其动力学特征；在国内，杨柳等[7]利用15N同位素示踪技术研究了太湖的浮游植物群落对不同形态氮的吸收速率特征.目前，玛珥湖研究主要集中在沉积与环境方面，而关于湖光岩玛珥湖浮游植物氮吸收的研究尚无相关报道.因此，本文利用稳定同位素示踪技术，研究浮游植物群落对溶解态氮的吸收及其动力学特征，了解浮游植物在氮循环中的作用规律，以期为湖光岩玛珥湖氮素生物循环的研究提供基础资料.
1 材料与方法 1.1 采样根据湖光岩玛珥湖生态系统稳定并且相对封闭的水文条件，本研究共设6个采样点(图 1)用于分析湖光岩玛珥湖浮游植物群落组成特征，并选择S4点位进行稳定同位素示踪技术测定浮游植物氮吸收实验.采样于2013年5月12、13日进行，用2.5L有机玻璃采水器采集水面下0.5m深水样进行现场培养实验.同时采水样500ml装入采样瓶中，用于测定水化指标.另采集1L水样，加15ml鲁哥试剂固定，用于浮游植物群落组成分析.采样的同时，用YSI 650 MDS型多参数水质监测仪(美国)测定采样水深处的温度(T)、pH值、溶解氧(DO)等指标，透明度(SD)用塞氏盘测定.测定氮吸收的浮游植物水样用180μm的绢网过滤除去大型浮游动物和碎屑，以排除对氮吸收的干扰[7].
1.2 水化指标测定与浮游植物分析水样用孔径为0.45μm的醋酸纤维滤膜抽滤后，滤膜用于叶绿素a测定，水样用于总溶解态氮、总溶解态磷、铵态氮、硝态氮、尿素等测定.其中总溶解态氮、总溶解态磷测定采用过硫酸盐氧化法[14]，尿素测定采用二乙酰一肟法[15]，铵态氮采用靛酚蓝分光光度法[16]，硝态氮采用紫外分光光度计比色法[14].浮游植物叶绿素a含量测定采用丙酮萃取分光光度法[17].浮游植物计数采用计数框行格法，浮游植物种类鉴定参照文献[18].
1.3 氮吸收实验测定浮游植物对不同形态氮的吸收速率，采用挂瓶的方法，在S4点位采集0.5m深处水样进行原位挂瓶，将1L水样加入1.1L透明聚乙烯培养瓶，再分别加入3种不同形态的氮稳定同位素示踪剂(15N-NH4Cl、15N-NaNO3、15N-Urea)，示踪剂丰度均为98 % (98 % atom 15N, Sigma-Aldrich)，在对应深度进行挂瓶培养.同时挂3个不添加同位素的空白瓶用来测定浮游植物的氮同位素自然丰度.添加的15N稳定同位素浓度要小于或等于环境氮浓度的10 %来计算氮的吸收速率[19].15N-NH4Cl、15N-NaNO3、15N-Urea添加浓度分别为0.05、0.10、0.05μmol/L，挂瓶4h后向瓶中加入饱和氯化汞溶液终止实验[10].带回实验室，用预先在450℃马弗炉中灼烧3h的Whatman GF/C滤膜抽滤，再抽滤10ml去离子水以清洗掉吸附在滤膜上的示踪剂.过滤后的膜放入70℃的烘箱中，48h后称重[7].最后用刀片刮下浮游植物，用Pressed Tin Capsules 5 mm ×9mm锡囊包装，藻体中δ15N和颗粒态氮(PN)由美国华盛顿州立大学实验室采用CF-ZRMS稳定同位素比例质谱仪(GV instruments Isoprime, Manchester, UK)测定.
参照如下公式，计算氮吸收特征参数.
比吸收速率V(h-1)[20]为：
| $ V = \frac{{^{15}{{\rm{N}}_{\rm{S}}}{ - ^{15}}{{\rm{N}}_{\rm{n}}}}}{{{(^{15}}{{\rm{N}}_{{\rm{enr}}}}{ - ^{15}}{{\rm{N}}_{\rm{n}}})\cdot T}} $ | (1) |
式中，15NS为实测样品的15N丰度，15Nn为浮游植物15N的天然丰度(0.366 %)，15Nenr为加入示踪剂后培养介质初始15N丰度，T为培养时间(h).
绝对吸收速率ρ(μmol/(L·h))[20]为：
| $ \rho = V\cdot {\rm{PN}} $ | (2) |
相对优先指数RPI[7, 20]、周转时间TT(h)[21]为：
| $ RPI\left( {\frac{{{\rm{NH}}_{_{\rm{4}}}^{^{\rm{ + }}}}}{{{\rm{DN}}}}} \right) = \frac{{\rho ({\rm{NH}}_{_{\rm{4}}}^{^{\rm{ + }}})}}{{\rho \left( {{\rm{DN}}} \right)}}/\frac{{[{\rm{NH}}_{_{\rm{4}}}^{^{\rm{ + }}}]}}{{\left[ {{\rm{DN}}} \right]}} $ | (3) |
| $ TT({\rm{NH}}_{_{\rm{4}}}^{^{\rm{ + }}}) = \frac{{[{\rm{NH}}_{_{\rm{4}}}^{^{\rm{ + }}}]}}{{\rho ({\rm{NH}}_{_{\rm{4}}}^{^{\rm{ + }}})}} $ | (4) |
式中，ρ(NH4+)为浮游植物群落对铵态氮的绝对吸收速率，ρ(DN)为浮游植物群落对铵态氮、硝态氮和尿素态氮绝对吸收速率之和.[NH4+]为培养介质中铵态氮浓度，[DN]为培养介质中铵态氮、硝态氮、尿素态氮浓度之和.RPI(NO3-/DN)、RPI(Urea/DN)计算公式与RPI(NH4+/DN)类似，TT(NO3-)、TT(Urea)的计算公式与TT(NH4+)类似.
1.4 氮吸收动力学实验吸收动力学实验采用浓度梯度法[10].采集0.5m深处水样1L加入透明聚乙烯培养瓶，再加入3种不同形态的氮稳定同位素示踪剂，进行现场挂瓶实验.示踪剂浓度梯度为0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μmol/L，每种形态氮设置3个重复.示踪剂浓度梯度代表的是N原子的摩尔浓度，一分子Urea含有两个N原子，因而Urea的添加浓度为以上浓度的一半[22].实验方法同1.3.
利用米氏(Michaelis-Menten)方程的Lineweaver-Burk plot法，将1/V对1/[S]作图回归计算米氏常数(KS)与最大比吸收速率(Vmax)，并通过对数作图进行吸收动力学曲线拟合.
| $ V = \frac{{{V_{{\rm{max}}}}\cdot S}}{{{K_{\rm{S}}} + S}} $ | (5) |
式中，S为底物浓度(μmol/L).
2 结果 2.1 浮游植物群落组成与环境特征共检测到湖光岩玛珥湖浮游植物7门54种(包括变种和变型)，主要为蓝藻门、硅藻门和绿藻门，分别占44.68 %、26.70 %和19.21 % (图 2).各点位浮游植物丰度范围为8.3×104~20.7×104cells/L.主要种类有水华微囊藻(Microcystis flos-aquae)、铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)、微小色球藻(Chroococcus minutus)、颗粒直链藻(Melosira granulata)、小球藻(Chlorella vulgaris)等，其中水华微囊藻与铜绿微囊藻为绝对优势种，优势度分别为0.39与0.28.
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图 2 湖光岩玛珥湖浮游植物群落结构组成 Fig.2 Phytoplankton community composition of the Huguangyan Maar Lake |
研究样点的水温约为30℃，pH值为7.83~8.10，溶解氧浓度范围为6.82~7.05mg/L，透明度为370 cm.光照、温度与pH等环境条件适合浮游植物的生长，春季浮游植物群落结构组成较为复杂.叶绿素a(Chl.a)含量均值为2.76μg/L，应用卡尔森营养状态指数(TSI)对研究水域水体营养状态进行评价，其叶绿素a分指数TSIM(Chl.a)为35.7，按照TSI指数在37以下为贫营养的标准[23]，湖光岩玛珥湖在春季表现出贫营养特征.本研究表明湖光岩玛珥湖不同采样点位的浮游植物群落组成与理化因子差异较小，生态系统稳定.
2.2 氮吸收特征 2.2.1 比吸收速率与绝对吸收速率氮吸收实验结果表明，浮游植物群落对铵态氮、硝态氮、尿素态氮的比吸收速率(V)分别为0.076、0.013、0.018h-1，对铵态氮的比吸收速率约为硝态氮的5.8倍，约为尿素态氮的4.2倍.浮游植物群落对铵态氮、硝态氮、尿素态氮的绝对吸收速率(ρ)分别为0.211、0.034、0.043μmol/(L·h)，浮游植物以铵态氮吸收占主导.湖光岩玛珥湖浮游植物对3种氮的比吸收速率与绝对吸收速率均表现为铵态氮>尿素态氮>硝态氮.
2.2.2 相对优先指数与周转时间湖光岩玛珥湖浮游植物氮吸收相对优先指数(RPI)是铵态氮>尿素态氮>硝态氮，分别为2.907、1.192、0.190，表明浮游植物群落优先吸收铵态氮，其次为尿素态氮，最后为硝态氮.湖光岩玛珥湖浮游植物群落对铵态氮、硝态氮、尿素态氮的吸收周转时间(TT)分别为3.72、57.03、9.07h, 表明湖光岩玛珥湖浮游植物对铵态氮的吸收周转快于尿素态氮和硝态氮. 3种溶解态氮的平均周转时间为23.27h.
2.3 δ15N的变化特征δ15N为样品中N元素稳定同位素比值与标准物(大气)相应比值的千分偏差[24].原位挂瓶4h后，分别对3种溶解态氮在不同15N示踪剂浓度条件下实验组样品的δ15N进行分析.数据分析使用SPSS 17.0统计软件，根据Duncan多重比较，使用单因素方差分析(ANOVA)进行检验.结果表明，在4h的15N富集挂瓶培养实验后，浮游植物样品中δ15N值远远高于初始浓度15N的δ15N值，表明浮游植物可以吸收15N分子(图 3).在3组实验中，在添加不同15N示踪剂浓度的条件下，挂瓶培养4h后，浮游植物的δ15N值差异显著(P < 0.05)(图 3)，随着15N示踪剂添加浓度的升高，浮游植物细胞富集δ15N值升高.添加15N底物浓度为10 μmol/L时，3种15N底物的浮游植物δ15N均达到最大，并且δ15N(NH4+)达到11285.3‰，是δ15N(NO3-)的26.4倍.湖光岩玛珥湖的浮游植物群落可以利用铵态氮、硝态氮、尿素态氮，而且对铵态氮的吸收富集显著高于尿素态氮和硝态氮.
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图 3 不同15N底物和不同浓度条件下，挂瓶4h实验后浮游植物δ15N值(各组间字母不同表示差异显著) Fig.3 Comparison of δ15N values of phytoplankton after the experiment when different substrate forms and concentrations of 15N were added |
湖光岩玛珥湖浮游植物群落对不同形态氮素的吸收速率均随15N底物浓度的增加而增大，并逐渐趋于饱和(图 4).对氮营养盐的吸收速率与其初始浓度之间的关系符合Michaelis-Menten方程V=Vmax·S/(KS+S).经Lineweaver-Burk作图法线性回归求得Vmax和KS.浮游植物群落对铵态氮的最大比吸收速率为2.943h-1，显著高于硝态氮和尿素态氮；浮游植物群落对3种溶解态氮的亲和力(1/KS)表现为硝态氮>铵态氮>尿素态氮.湖光岩玛珥湖浮游植物群落对铵态氮具有最大的吸收潜力，同时对硝态氮具有一定的亲和力，具备利用硝态氮的能力(图 4).
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图 4 湖光岩玛珥湖浮游植物群落氮吸收动力学曲线 Fig.4 Nitrogen uptake kinetic curves for phytoplankton in the Huguangyan Maar Lake |
铵态氮是浮游植物最喜好的氮形态，因为与其它形态氮相比，吸收NH4+所消耗的能量最少[7].浮游植物细胞可以获得各种形态的含氮分子，含氮分子进入细胞膜后会还原为NH4+并结合到氨基酸碳链上；在外部NH4+浓度小于1μmol/L时，浮游植物细胞膜上存在NH4+转运蛋白，所以NH4+可以透过细胞膜[25].硝态氮通过主动运输进入浮游植物细胞，在硝酸盐还原酶和亚硝酸盐还原酶的作用下先还原为亚硝酸盐，然后还原为NH4+；而尿素分子需酶解为2个NH4+和1个CO2分子，再被浮游植物细胞利用[26].浮游植物对溶解态氮的吸收效率受控于其ntc A基因编码的一种调控蛋白[27-28]，当环境NH4+浓度大于1 μmol/L时会抑制ntc A基因的表达[29]，在缺乏NH4+的条件下ntc A基因编码的调控蛋白可以促进硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶和脲酶基因的表达[25, 27].因此，一般在NH4+浓度相对较低的情况下浮游植物吸收NH4+的速率均超过其他几种溶解态氮，当NH4+浓度大于1μmol/L时浮游植物对其它形态氮的吸收也会出现偏好的现象[30].
经测定，湖光岩玛珥湖的环境NH4+浓度为0.735μmol/L，小于1μmol/L，湖光岩玛珥湖浮游植物群落对NH4+的吸收速率最高，其对3种氮的绝对吸收速率顺序为：ρ(NH4+)>ρ(Urea)>ρ(NO3-)，这与Smith湖、Okeechobee湖、Biwa湖中浮游植物对铵态氮、硝态氮和尿素态氮吸收情况的研究结果相符[9-10, 31]，表明湖光岩玛珥湖春季浮游植物群落对铵态氮的吸收速率最高，铵态氮是该湖泊浮游植物吸收氮的主要形态.
3.2 不同形态氮的吸收选择性浮游植物对不同形态氮的吸收优先性与浮游植物群落结构有关，氮的存在形态也会影响浮游植物的群落结构[32-33].McCarthy等[34]提出了RPI的概念，用于表征哪一种氮源是浮游生物优先利用的形式.相对优先指数等于1，表明浮游生物对该营养盐的吸收正比于其提供量；相对优先指数大于或小于1，表明相对于提供量而言，浮游生物具有较快或较慢的吸收速率[11].Wheeler等[35]证明铵态氮的吸收是水域生态系统氮吸收的主要部分之一，这与原核生物的生命活动密切相关.本研究结果表明，湖光岩玛珥湖浮游植物群落组成中，原核生物中的蓝藻为主要组成部分，占44.68 %，其绝对优势种为水华微囊藻与铜绿微囊藻.湖光岩玛珥湖浮游植物对铵态氮吸收的相对优先指数高，表明除了吸收铵态氮所消耗能量最少的内因之外，该湖泊中以蓝藻门为主的浮游植物群落组成对其也有一定影响.湖光岩玛珥湖浮游植物群落对铵态氮吸收的相对优先指数大于硝态氮和尿素态氮，铵态氮是湖光岩玛珥湖浮游植物优先利用的氮源.硝态氮的相对优先指数相对较低而周转时间较长，硝态氮是湖光岩玛珥湖浮游植物群落吸收的一种次要氮源.因此，铵态氮、硝态氮、尿素态氮都是湖光岩玛珥湖浮游植物可吸收的氮源，而浮游植物更偏好铵态氮.
3.3 吸收动力学浮游生物营养吸收动力学的研究目的主要在于获得浮游生物对营养盐吸收方面的有关参数，并通过这些参数对浮游生物的生态习性和特点作出推断和阐释，从而了解它们在生态系统中的作用和功能[13].Michaelis-Menten方程是表示一个酶促反应的起始速度与底物浓度关系的速度方程[36].Suttle等[37]的研究表明，浮游植物对氮的吸收过程可用Michaelis-Menten方程来描述.Vmax表征细胞对营养离子的吸收潜力，KS表征细胞对营养离子的亲和力[38].
本实验中，湖光岩玛珥湖浮游植物对铵态氮、硝态氮、尿素态氮的吸收动力学符合Michaelis-Menten方程(图 4).铵态氮的Vmax高于尿素态氮和硝态氮，表现出浮游植物群落对铵态氮具有较高的吸收潜力.铵态氮、尿素态氮的KS分别约为其环境浓度的2.6倍和11.5倍，而硝态氮的KS低于其环境浓度，这个结果与Gu等[9]对Smith湖的研究结果相似.湖光岩玛珥湖浮游植物群落对硝态氮的KS最小，说明在环境氮浓度较低的条件下浮游植物细胞对硝态氮具有一定的亲和力，具备利用硝态氮的能力.
3.4 湖光岩玛珥湖溶解态氮吸收的重要性氮是湖泊水体的营养限制因子[39-41].湖泊生态系统中氮的生物地球化学循环是生物圈物质能量循环的重要组成部分，浮游植物对溶解态氮的吸收、转化是湖泊中氮生物循环的关键环节.本研究结果表明，湖光岩玛珥湖中铵态氮、硝态氮、尿素态氮都是浮游植物可吸收的氮源，浮游植物对这几种氮的吸收动力学曲线均可通过Michaelis-Menten方程进行描述，并且浮游植物对铵态氮表现出高吸收速率，更偏好利用铵态氮.浮游植物对溶解态氮的吸收转化作用一定程度上降低了水体氮浓度，参与湖泊中氮素的生物循环，对湖泊水体自净起了重要的生物学作用，另外，有关浮游植物氮吸收的深入研究也有助于进一步丰富湖泊浮游植物的营养理论.
致谢: 古滨河在同位素样品测定和实验方法上提供的重要帮助，刘新宇、曾园园、梁辉健、李新宇等协助完成采样工作，在此向他们表示衷心的感谢.| [1] |
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