2016, Vol. 28 
微囊藻(Microcystis spp.)是一个在全世界广泛分布，在富营养化的水体中频繁发生水华的蓝藻种类[1].在野外条件下，微囊藻大都以群体形式存在.微囊藻群体主要是以微囊藻分泌的胞外多糖为主要成分的胶鞘围绕在藻细胞周围形成[2].研究表明相比单细胞状态的微囊藻, 群体微囊藻更能耐受低温、黑暗等条件[3]，并且可以抵御浮游动物的捕食[4-5].微囊藻群体胶鞘能够吸收生长所必需的金属元素[6]，在微囊藻的漂浮以及群体结构的维持中起到重要的作用[7].除此之外，胶鞘对微囊藻群体的形态和大小有着重要的影响，而藻细胞表面的多糖在藻细胞聚合形成群体中发挥着重要作用[8-10].
微囊藻水华在一年中经过衰亡休眠、复苏、生物量增加和上浮积聚4个阶段[11]，其中在秋、冬季节，微囊藻水华进入衰亡阶段，除了小部分微囊藻群体仍然停留在水柱或者下沉到底泥中越冬，成为来年春季复苏的主力军[12]，大部分微囊藻群体消失[13].胶鞘多糖是微囊藻在湖泊浮游植物中占据优势的主要原因之一.水华衰亡期间，随着温度的逐渐下降，微囊藻群体胶鞘多糖的分泌可能会受到影响.已有相关研究表明，多糖的合成受到环境条件的影响[14-17].然而，关于微囊藻水华衰亡过程中胶鞘的变化目前研究仍然较少.
为了揭示对维持微囊藻群体优势起关键作用的胶鞘在水华衰亡过程中的变化，本研究探讨了太湖梅梁湾水华衰亡过程中的微囊藻群体大小以及单位藻细胞多糖的变化，并采用能谱扫描电镜(SEM-EDS)方法研究了微囊藻群体胶鞘和元素组成的变化.
1 材料与方法 1.1 微囊藻群体大小组成和单位细胞胶鞘多糖含量的变化 1.1.1 样品的采集和不同大小群体藻细胞数分析在微囊藻水华衰亡期间(10月至次年1月)，在太湖梅梁湾用25#浮游生物网收集微囊藻群体，依次用180、100和50 μm尼龙筛绢过滤后，采用超声波破碎仪，在30~40 W工作功率下，超声1 min，将群体打散[18]，采用血球计数板计数每部分的细胞个数，用来计算组成不同大小群体的细胞数的比例.
1.1.2 苯酚硫酸法分析单位细胞胶鞘多糖含量的变化采用苯酚硫酸法分析微囊藻群体胶鞘多糖[19].具体方法是收集一定体积湖水中的微囊藻群体，浸泡在终浓度为3%的戊二醛中，在4℃进行多糖提取[20].以6000转/min离心10 min收集上清液，采用3500道尔顿透析膜透析后用于微囊藻群体胞外多糖浓度的测定.藻群体沉淀重新悬浮于相同体积的GF/C膜滤过的湖水中，采用1.1.1节中所述的方法打散藻群体计数藻细胞.
葡萄糖标准曲线的绘制及样品多糖浓度的测定.准确称取干燥至恒重的无水葡萄糖20 mg于500 ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0. 8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8 ml，用水补至2.0 ml，然后加入5%苯酚1 ml摇匀，接着垂直加入浓硫酸5.0 ml，使浓硫酸迅速冲下去的同时起到混匀的效果，室温放置20 min后摇匀，在490 nm处测光密度，2.0 ml水按同样的显色操作为空白对照，横坐标为多糖浓度(μg/ml)，纵坐标为光密度值，得到标准曲线.取样品液1.0 ml，按以上操作步骤测定光密度值，根据标准曲线公式计算对应多糖浓度(mg/L).将多糖浓度除以细胞总数可得单位藻细胞的多糖含量.
1.2 微囊藻群体胶鞘的显微分析 1.2.1 阿利新兰(Alcian blue)染色用蒸馏水配制1%的阿利新兰染液，用稀盐酸分别调节pH值到2.5和0.5，在这两种pH值下该染料分别能选择性结合酸性多糖和硫酸多糖而使多糖呈现蓝色[21]，以此证明两种多糖的存在.同时经过染色，原本无色透明的胶鞘将变得清晰可辨.吸取两种pH值下该染料各1.0 ml加入1.5 ml离心管中，加入少量微囊藻群体，染色30 min后，用蒸馏水冲洗微囊藻群体，直接于光学显微镜下观察并拍照.
1.2.2 能谱扫描电镜(SEM-EDS)分析微囊藻群体在2.5%的戊二醛溶液中固定保存直到扫描电镜样品的制作.样品的前处理过程如下：首先用0.01 mol/L的磷酸缓冲液将微囊藻群体洗3次，以去除戊二醛.然后依次用不同浓度(30%、50%、70%、80%、90%、100%，v/v)的乙醇溶液进行梯度脱水，最后在空气中风干.样品在喷镀金膜后，在扫描电镜(JSM-5610LV/Vantage Ⅳ)下，对样品中随机选定的微囊藻群体进行形貌特征观察并拍照，同时，利用与扫描电镜相偶联的X射线能谱仪(实验所用电压为15 kV)进行微囊藻群体表面元素组成分析，通过获取二次电子图像得到主要组成元素的相对重量百分比.
2 结果与分析 2.1 微囊藻群体大小组成与微囊藻单位细胞胶鞘多糖含量分析随着水华的衰亡，大于180 μm的微囊藻群体趋于减少，50~100 μm的群体在总群体中所占的比例变化不大，而100~180 μm的群体显示出增加的趋势(图 1).微囊藻群体中大于180 μm的比例在11月上旬之前出现增加趋势，可能是群体体积较小的惠氏微囊藻(M. wesenbergii)的比例逐渐减少，而群体体积较大的铜绿微囊藻(M. aeruginosa)比例增多，导致总体上大群体的增多；11月上旬之后，大于180 μm的比例逐渐减少，有两个方面的原因：一方面是由于存在不同形态的微囊藻的演替，如从铜绿微囊藻向水华微囊藻(M. flos-aquae)的演替，一般铜绿微囊藻群体平均大小大于水华微囊藻群体；另一方面是由于大群体裂解成为小的群体.
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图 1 水华衰亡过程中微囊藻群体大小组成变化 Fig.1 Changes in size fractionated Microcystis colonies during the bloom decline period |
葡萄糖的标准曲线为：y=0.007x-0.016，R2=0.99，据此公式得出：在微囊藻水华衰亡过程中的微囊藻群体中，单位细胞产生的胞外多糖含量总体呈现先增加后减少的趋势，从8.9±0.6 pg/cell增加到25.8±1.8 pg/cell，然后下降到3.4±0.3 pg/cell(图 2).在11月上旬之前，多糖含量的增加与大于180 μm的藻群体的增加一致，可能与微囊藻不同种类的演替有关，而在11月之后，单位细胞产生的胞外多糖含量的下降，与多糖合成受到环境因素如温度、光照以及不同微囊藻种属的影响有关[22].值得注意的是本文针对的是微囊藻群体的附着多糖，即微囊藻群体胶鞘中的主要组分，在微囊藻形成群体上发挥着重要作用[10].多糖产量减少会影响群体大小[23]，引起胶鞘发生变化.
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图 2 水华衰亡过程中单位微囊藻细胞多糖含量的变化 Fig.2 Changes in polysaccharide content of Microcystis colonies during the bloom decline period |
微囊藻群体经过阿利新兰染色，胶鞘结构明显，围绕在微囊藻细胞周围，pH值为0.5(图 3A)和2.5(图 3B)都可将微囊藻群体染色，显示群体中含有酸性多糖和硫酸多糖，这与以往报道的结果相似[19, 24-25].在正在裂解和已经破碎的微囊藻群体中(图 3C、D)，可以看到微囊藻群体胶鞘的开裂，破碎的藻群体中含较少细胞的胶鞘碎片，说明了微囊藻群体的裂解以及藻细胞的脱落.
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图 3 微囊藻群体的阿利新兰染色结果：(A) pH值为0.5时所染色的微囊藻群体；(B) pH值为2.5时所染色的微囊藻群体；(C)正在裂解的微囊藻群体(pH值为2.5)；(D)破碎的微囊藻群体(pH值为2.5) Fig.3 Microcystis colonies stained with alcian blue: (A) colony stained at pH 0.5; (B) colony stained at pH 0.5; (C) being cracked colony stained at pH 2.5; (D) broken colony stained at pH 2.5 |
扫描电镜分析结果显示，不同时间的微囊藻群体胶鞘形态明显不同.在10月、11月8日和11月15日采集的微囊藻群体具有较完整的胶鞘结构，细胞结合紧密，并包裹在胶鞘中(图 4A、B、C、D)，说明此时的微囊藻群体还没有开始衰亡.而在后面的几个时期即11月25日、12月以及1月所采集的微囊藻群体，胶鞘结构趋于破碎，质地变硬，胶鞘出现裂解，胶鞘内的细胞外翻，细胞分散地裸露在胶鞘的表面(图 4E、F、G、H)，一些藻细胞从群体中脱落出去，表现为采回来的微囊藻群体很容易解散.这说明随着水华的衰亡，维持微囊藻群体结构的胶鞘逐渐老化，藻细胞脱落，使得部分微囊藻不能维持群体的状态，从而被浮游动物捕食，或者因为没有胶鞘的保护而无法耐受低温环境而死亡，因为单细胞的微囊藻对低温和黑暗的耐受都低于群体状态的微囊藻[3]，从而导致微囊藻水华的衰亡.
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图 4 水华衰亡过程中微囊藻群体胶鞘的扫描电镜照片：A、B、C、D、E、F、G和H分别是10月13日、10月26日、11月8日、11月15日、11月25日、12月6日、12月21日和1月9日所采集的微囊藻群体(图中的电镜扫描照片代表该时期大部分微囊藻的群体状态) Fig.4 Scanning electron micrographs of Microcystis colonies during the bloom decline period: A, B, C, D, E, F, G and H showed samples on 13 October, 26 October, 8 November, 15 November, 25 November, 6 December, 21 December and 9 January, respectively |
元素组分分析结果显示(图 5)，除了高含量的碳和氧元素(两者含量相对稳定，在主要组成元素中分别占60%和30%左右，图 5A)，以及部分群体中有含量较低的钾(K)、镁(Mg)、铁(Fe)以及氯(Cl)元素(图 5D)之外，主要的元素有钙(Ca)、硅(Si)、钠(Na)、铝(Al)、磷(P)和硫(S)(图 5B、C)，其中含量最高的是Na、P、Ca和Si元素，这几种元素的相对重量百分比在水华衰亡过程的微囊藻群体中发生了变化.其中Ca和Si元素在几个主要的元素组分中的比例呈增加趋势，Na和P元素所占的比例则呈现波动下降的趋势，Al和S元素则围绕初始值上下浮动.
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图 5 微囊藻群体胶鞘主要元素组成 Fig.5 Elements composition in sheath of Microcystis colonies determined by SEM-EDS |
微囊藻的胶鞘具有吸附微量元素的作用，能够供给藻细胞生长必须的元素[26].胶鞘的吸附功能实际上是源于其主要组分多糖对于金属元素的吸附，吸附的机理包含络合、离子交换和表面沉降等，吸附能力与环境温度，pH值，离子强度、形态和种类有关，但主要还是取决于多糖本身结构和功能基团如羧基、羟基、磷酸基等[27].因此，胶鞘表面元素含量的变化在一定程度上反映了胶鞘多糖对元素吸附功能的变化.因而对于了解微囊藻群体所处的状态有重要的参考作用.在所检测到的主要元素中，碳和氧含量很高，说明了所检测的颗粒物质来自于胶鞘，而非非生物杂质颗粒.除此之外，含量比较高的元素有Na、P、Ca和Si.其中Na、P元素是藻生长必需的元素之一，能够影响藻的大多数代谢活动，尤其是光合作用[2829]. Si元素存在于微囊藻群体中已有相关报道[30]，但是其作用机制并不清晰.微囊藻胶鞘多糖中所含有的酸性多糖能够高效地螯合金属离子，尤其是Ca离子[31]，而Ca的浓度会影响到微囊藻多糖产量和群体大小[32].也有研究报道蓝藻表面含有较高含量的Ca和Si元素，可以导致蓝藻的钙化和硅化[33-34].我们推测在温度逐渐降低的过程中，微囊藻细胞产生胞外多糖含量减少，而胶鞘吸附的钙和硅元素相对增多，伴随着胶鞘的质地变硬、变脆、易于裂解，从而导致了水华的衰亡.
3 结论在富营养化水体中，每年秋、冬季节微囊藻水华开始衰亡，然而衰亡的机制并不清楚.微囊藻维持优势的一个重要原因是其具有胶鞘，形成群体.因此，本文对太湖梅梁湾微囊藻水华衰亡过程中微囊藻群体的胶鞘结构变化进行了分析.结果表明：随着蓝藻水华的衰亡，大于180 μm的微囊藻群体趋于减少，而100~180 μm的群体显示出增加的趋势；单位细胞产生的胞外多糖含量呈下降的趋势；胶鞘结构趋于破碎，质地变硬，胶鞘出现裂解，胶鞘内的细胞外翻，一些藻细胞从群体中脱落出去，表现为采回来的微囊藻群体很容易解散.胶鞘中的Na和P元素所占的比例则呈现波动下降，Ca和Si元素的比例呈增加的趋势.
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