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(2: 中国水利水电科学研究院, 北京 100038)
(3: 首都师范大学首都圈水环境研究中心, 北京 100048)
(2: China Institute of Water Resources and Hydropower Research, Beijing 100038, P. R. China)
(3: Research Center of Aquatic Environment in the Capital Region, Capital Normal University, Beijing 100048, P. R. China)
河流是全球碳循环的主要输送通道，是陆地有机质参与生物地球化学循环的重要场所[1]，其水—气界面二氧化碳与甲烷的排放构成全球碳循环的重要环节[2].全球河流每年向大气排放1.5~26.8 Tg的甲烷，其对全球气候变暖的贡献不容小视[3-4].甲烷在沉积物—水界面向水体扩散时，约33 % ~99 %的甲烷会被甲烷氧化菌的氧化作用消耗.好氧甲烷氧化菌(MOB)以甲烷作为唯一的碳源，能将90 %由产甲烷菌产生的甲烷氧化[3-4].
由于人类活动的影响，大量未经处理的生活污水、工业废水及农田化肥等含有大量有机质和氮素的污水汇入河流，导致河流中氮素、溶解态有机碳与溶解态无机碳之比及氮磷比升高，对河流中微生物群落结构产生影响[5-8].其中，外源氮对MOB氧化作用的影响主要依赖环境中氮的存在形态[9]，输入氮形态和浓度水平不同对甲烷氧化过程的影响也不同[10].普遍认为铵态氮(NH4+-N)和硝态氮(NO3--N)均对亚硝酸盐还原性厌氧甲烷氧化菌(N-DAMO)的氧化有抑制作用[11]，NH4+-N对MOB氧化率的抑制性高于NO3--N对甲烷氧化作用的抑制性[12]. NH4+与甲烷有相似的分子结构，通过竞争甲烷单加氧酶系统相同的位点或降低甲烷氧化酶活性，从而抑制N-DAMO细菌的氧化作用[13].外源氮素对MOB氧化作用的影响主要依赖于氮素的浓度水平，较高浓度的NH4+-N对MOB甲烷氧化率的抑制性高于低浓度NH4+-N的抑制性[12-13]目前氮素形态及其浓度对甲烷氧化作用的研究主要集中于农田土壤不同施肥状态下甲烷氧化微生物的群落特征、室内模拟不同氮素形态和不同浓度对甲烷氧化的影响等，而对于人类活动干扰程度及污染程度强的城市河流中氮素形态和浓度差异对MOB群落特征影响的研究还明显不足.
北运河作为北京市主要的泄洪排污河道，流经北京市人类活动最频繁的东部和北部地区，受到人类活动干扰大[14].水质污染严重，主要污染物为氮、磷和耗氧有机物，其中超过50 %的氮、磷和耗氧有机物来自未经处理的生活污水及农业灌溉径流的汇入[15].北运河的排水河流主要有清河、坝河、通惠河、凉水河4大排水河道，其中清河中有肖家河和清河2座污水处理厂；坝河主要接纳北小河和酒仙桥2座污水处理厂退水；通惠河是城区雨水管网的排水河道，接纳高碑店污水处理厂退水；凉水河主要接纳方庄酒厂、吴家村、卢沟桥、小红门和亦庄开发区5座污水处理厂退水，凉水河是4大排水河道中接纳污水处理厂最多、受污水处理厂退水影响最大的支流，其中仍有未经处理的污水及氮磷处理效率低的污水处理厂的出水汇入河道[14].未经处理的工农业废水、城市生活污水及污水处理厂退水的汇入导致北运河水体中NH4+-N严重超标，河流水体的NH4+-N浓度已经达到地表水Ⅴ类水质标准的7.25倍[15-16].河道水流缓慢导致沉积物大量淤积，而污染物质的沉降、吸附使得沉积物成为内源污染源[15, 17].北京市经济的发展和人口的增长使北运河水体受到严重污染，已经成为北京市水质最差的城市河流[18].
北运河中浓度较高的NH4+-N是否存在空间及季节差异性以及沉积物中氮素的主要存在形态和浓度的变化是否会对MOB群落特征产生影响是本文探讨的主要问题.本文选取北京市主要城市河流——北运河作为研究区域，采用克隆文库的方法，通过分析不同季节、不同空间样点沉积物中氮素形态及浓度的差异性，探究氮素形态和浓度的不同对MOB群落分布、系统发育树及种间共存现关系的影响，进一步明确氮素的存在形态及其浓度水平对微生物群落特征及其氧化作用的影响.该研究可以为控制城市河流中甲烷气体的释放提供科学依据，为进一步解释河流及湖泊富营养化与气候变化的联系及可能具有的反馈效应提供理论基础.
1 材料与方法 1.1 样品采集采样点主要布设在北运河北京段.如图 1所示，共设置7个采样点，其中北运河北京段的中游布设1#、2#和3#样点，下游布设4#、5#、6#和7#样点.分别于2016年1月和2016年7月使用抓泥斗采集底泥(0~5 cm)样品约1 kg.
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图 1 北运河采样点分布 Fig.1 Distribution of sampling sites in the North Canal |
样品储存于聚氯乙烯塑料瓶(-4℃)中，24 h内运回实验室.所有样品均分为两部分：一部分用冷冻干燥机(Alpha 1-2 LD plus; Martin Christ, Germany)冻干，研磨过200目筛后用于理化分析；另一部分放入-80℃超低温冰箱保存，用于后续分子生物学指标测定.
1.2 样品理化分析温度(T)、pH、溶解氧(DO)、盐度(Salinity)等水质指标使用多参数水质仪(HYDROLABMS5)(HACH，美国)现场测定.其他理化指标依照《土壤理化分析(第5版)》的方法进行测定[19].沉积物中NH4+-N、NO3--N、亚硝态氮(NO2--N)和总磷(TP)，用2 mol/L KCl溶液浸提，浸提悬浮液离心过滤，使用FIASTAR 5000连续流动进样分析仪(FOSS，丹麦)测定；总有机碳(TOC)使用总有机碳分析仪测定(Liqui TOCⅡ，德国)；总氮(TN)按照凯式定氮的方法使用凯氏定氮仪(KDY-9830)测定, 总溶解性固体(TDS)采用TDS11总溶解性固体检测仪测定(HANNA, 意大利).
1.3 DNA提取和pmoA基因PCR扩增沉积物样品DNA使用Power Soil DNA kit(Mo Bio Laboratories, Carlsbad, California, USA)试剂盒，依据说明书提取. MOB的pmoA基因PCR扩增反应体系为：DNA模板10 μl，前后引物各2 μl，2×Taq PCR Master Mix (天根生化科技，北京)25 μl，加蒸馏水(ddH2O)到总体积为50 μl. MOB的pmoA基因PCR扩增引物为A189F (5′-GGNGACTGGGACTTCTGG-3′)和Mb661R (5′-GGTAARGACGTTGCNCCGG-3′)，PCR扩增的主要温度程序为：94℃预变性5 min；94℃变性45 s，56℃退火60 s；72℃延伸60 s，共30个循环；最终72℃延伸60 s[20].每个样品做两组平行取平均值，扩增效率为100 %，相关系数为0.99.
1.4 数据分析使用MOTHUR软件以2 %的差异度划分独立操作单元(operational taxonomic unit, OTU)，计算Shannon多样性指数、Simpson指数和Chao1指数[21].采用MEGA 4软件[22]以邻位相连法(Neighbor-Joining)构建系统发育树.通过STAMP软件[23]基于T检验方法计算两样本之间的差异显著性.使用R 3.3.2的psych package 1.7.5[24]计算样本间微生物之间的共存关系，并进一步使用Cytoscape 3.5.1软件[25]绘制微生物的共存关系网络图.采用R 3.3.2软件的Vegan package 2.4[26]用于冗余分析(RDA).采用SPSS(PASW statistics 18.0)软件对理化数据进行统计分析.
2 结果与讨论 2.1 水体和沉积物理化指标北运河中游和下游水体及沉积物理化指标测定结果如表 1所示，其中T、pH值、DO浓度和TDS浓度为水质参数，NO3--N、NO2--N、NH4+-N、TOC、TN和TP含量为沉积物中的营养盐参数.
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表 1 北运河中游和下游水体及沉积物中营养盐变化(平均值+标准差) Tab.1 Nutrient variations in water and sediment of midstream sites and downstream sites in the North Canal (Means±SD) |
夏季沉积物中NH4+-N和NO3--N含量分别占无机氮总含量的76.53 %和13.37 %，冬季NH4+-N含量占无机氮总含量的比下降到77.02 %，而NO3--N含量占无机氮总含量的比例上升到22.89 %.
对北运河水体及沉积物理化指标进行空间差异性分析，结果表明，夏季和冬季中下游沉积物NH4+-N含量均显著高于中游(P＜0.05)，而中游沉积物中C/N均显著高于下游(P＜0.05)(图 2).季节差异分析发现，与冬季相比，夏季沉积物中TP含量更高(P＜0.05)，而冬季NO3--N含量、TDS和盐度(Salinity)更高(P＜0.05).除以上指标存在空间和季节性差异之外，其他指标均没有显著差异(P>0.05).
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图 2 北运河中、下游夏季(a)和冬季(b)水体及沉积物理化指标在空间上的差异性 Fig.2 Differences of nutrient variations in water and sediment between midstream sites and downstream sites in the North Canal (a: summer, b: winter) |
由于采样点主要位于人类活动干扰大的中游和下游，大量未经处理的工农业废水和生活污水汇入北运河，导致河流污染严重[18].北运河中较高含量的NH4+-N主要来自支流中工业废水的汇入和农田灌溉的输入，其中凉水河支流的汇入对北运河中TN和NH4+-N负荷的贡献较大[15].有研究表明北运河水体中污染物质主要来自工业废水的排放，其次为生活污水和农业面源污染，下游TN和NH4+-N负荷主要来自上游及支流凉水河的共同聚集[15].北运河下游汇集了中下游各个支流的河水和岸边农田土壤的径流，导致沉积物中NH4+-N累计含量较高.人类活动及土地利用对河流水体中污染物质的主要存在形态产生了影响.
2.2 MOB多样性指标北运河夏季和冬季沉积物共扩增MOB的基因序列331条，序列覆盖范围为0.62~0.88，具有代表性.基于2 %的基因差异，夏季沉积物MOB基因序列共划分出7~17个OTUs，Shannon多样性指数范围为0.99~2.51，Simpson指数范围为0.16~0.49；冬季沉积物MOB基因序列共划分出3~15个OTUs，Shannon指数范围为0.69~2.12，Simpson指数范围为0.13~0.36.
沉积物中MOB多样指数在空间和季节上均没有显著差异性(T检验，P>0.05).基于Bray-Curtis距离，沉积物中MOB的heatmap聚类分析显示，MOB呈现空间和季节聚类的特点，即中游低氮素样点(1#~3#)和下游高氮素样点(4#~7#)分别聚在一起，且夏季和冬季样点分别聚在一起(图 3).温度是影响甲烷好氧氧化过程的重要环境因子，温度的变化影响MOB的氧化活性，从而对甲烷气体的传输和释放产生影响[27].
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图 3 MOB的heatmap分析 (低氮素样品：1#、2#和3#样点；高氮素样品：4#、5#、6#和7#样点；A：夏季；B：冬季) Fig.3 Heatmap representing the differences of microbial communities among samples based on Bray-Curtis distance (Low-nitrogen samples: 1#, 2# and 3#; High-nitrogen samples: 4#, 5#, 6# and 7#; A: Summer; B: Winter) |
云南不同土地利用类型的淡水湖泊底泥中MOB划分OTUs的个数为16~23，Shannon指数为2.53~2.79[28]. Liu等[20]在中国云南高原13个富营养淡水湖泊底泥中发现MOB共划分出11~30个OTUs，Shannon指数为2.24~3.12.北运河沉积物中MOB的OTUs个数和Shannon指数与淡水生态系统相一致[20]. heatmap的聚类结果与北运河沉积物中氮素的空间差异性一致，低NH4+-N含量的中游样点聚在一起，高NH4+-N含量的下游样点聚在一起，沉积物中NH4+-N含量对MOB群落分布有影响.
2.3 MOB系统发育树及群落结构差异选取MOB具有代表性的基因序列进行克隆文库系统发育树分析.北运河MOB共分为4个分支，分别为ClusterⅠ、ClusterⅡ、Cluster Ⅲ和Cluster Ⅳ(图 4).其中ClusterⅠ为最大的分支，包括129条基因序列，占据了整个基因序列的37.18 %，该分支的基因序列中有91.47 %来自下游样点(4#~7#)，与废水淤泥[29]和活性淤泥[30]中MOB基因序列有较高的同源性，与来自池塘底泥纯培养的Methylococcaceae bacterium R-49797(Ⅰ型MOB)有较高的同源性. ClusterⅡ为第2大分支(27.38 %)，共95条基因序列，该分支的基因序列在中下游均匀分布(中游：46.32 %；下游：53.68 %)，与湖泊沉积物[31]中MOB基因序列的同源性较高. Cluster Ⅳ共有88条基因序列(25.36 %)，该分支的基因序列在中下游均匀分布(中游：55.68 %；下游：44.32 %)，与来自稻田土壤以及稻田根际土壤的MOB同源性较高，且与纯培养的Methylocystis sp. KS30和Methylocystis SS2C3(Ⅱ型MOB)也有较高的同源性. Cluster Ⅲ为最小的分支，包含了35个基因序列，占基因序列的10.09 %，与湖泊沉积物及湿地土壤来源的相关基因序列的同源性较高，与纯培养Methylocystis sp. LW5(Ⅱ型MOB)有较高的同源性.
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图 4 北运河沉积物中MOB基因序列的系统发育树 Fig.4 Phylogenetic tree of representative pmoA sequences and reference sequences from GenBank in the North Canal |
有研究表明，淡水沉积物中MOB以TypeⅠ型的Methylomonas、Methylobacter和Methylosarcina等属为主[9].对云南13个淡水湖泊[32]以及美国阿拉斯加北部Qalluuraq湖泊[33]中MOB的研究均发现TypeⅠ型甲烷氧化菌是湖泊沉积物中的主要细菌群落.北运河沉积物中MOB以TypeⅠ型为主.北运河缺乏自然径流，主要依靠污水处理厂的再生水补给，再生水携带设施中的微生物一同汇入北运河，岸边农田土壤随着雨水汇入河流[18].北运河沉积物中MOB高同源性菌群主要来自污水处理厂出水和废水淤泥沉积物.鲍林林等[34-35]对北运河沉积物中的脱氮功能微生物和氨氧化微生物群落特征的研究均表明脱氮功能微生物和氨氧化微生物均与污水处理厂废水和活性污泥中发现的类群同源性高，这与本研究中MOB群落的相关研究结果一致.农田土壤中有关MOB的研究表明，Ⅱ型MOB占主导地位[28]. MOB的系统发育树Cluster Ⅲ分支中MOB高同源性菌群的来源与该分支样点污染物的来源一致.
2.4 MOB共存网络关系结构共存网络关系结构(Co-occurrence Network)可以用来评估复杂生态系统中微生物之间的相互关系[36-37]，描述栖息地环境特征与微生物群落之间的聚集关系[38-39].网络结构拓扑图中点的分布及点与点之间的相互关系能影响系统的稳定性[39-40].
通过Pearson相关性分析，选取MOB相关关系显著的OTUs(P＜0.05)，构建拓扑结构图.空间上，中游共16个显著相关的节点，26条相关线(图 5a)；下游显著相关的节点共38个，相关线120条(图 5b)，同上游的网络关系相比，下游集聚系数更高，特征路径更长，网络关系较复杂，与氮素有显著相关的OTU个数较多.季节上，夏季OTUs的网络结构图中共有25个显著相关的节点，72条相关线(图 6a)；冬季有显著相关的节点38个，相关线100条(图 6b).两季节网络结构的异质性程度和模块化程度均较高.夏季的网络结构集中化程度和网络结构的集聚系数高于冬季的相应参数.与冬季的聚类程度相比，夏季聚为3类，其中一部分聚集规模较大，聚集程度较强，该部分OTUs主要受NH4+-N和NO3--N的共同影响.
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图 5 北运河中游(a)和下游(b)MOB的co-occurrence network分析 (线段代表相关性，只有P＜0.05的相关关系在图中显示，下同) Fig.5 The co-occurrence network of MOB bacteria communities in midstream (a) and downstream (b) of the North Canal (Line segments represent correlation; only strong and significant relationships (spearman r>0.7, P < 0.05) are shown; The same below) |
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图 6 北运河夏季(a)和冬季(b)MOB的co-occurrence network分析 Fig.6 The co-occurrence network of MOB bacteria communities in summer (a) and winter (b) in the North Canal |
模块化程度(modularity)>0.4表明网络拓扑图已经形成模块化[41]，更高的模块化程度反映出更强的生态位分化程度[39]，生态位的分化程度越高，其为物种提供的生态位越多[42-43].北运河中游和下游、夏季和冬季OUTs的模块化程度均较高，因此空间和季节变化对MOB群落的生态位分化影响较小.网络结构参数中的聚集系数(clustering coefficient)及特征路径长度(characteristic path length)表征网络关系图中节点与节点之间紧密联系的程度[44]，一般而言聚集系数越大，节点彼此之间的联系越紧密，相关关系线越短[43, 45]，物种之间相关关系越紧密，受到环境变化的干扰程度越高[42, 46].与中游的OTUs聚集系数相比，下游的集聚系数更高，表明沉积物中MOB对环境变化的敏感程度有空间变化特征，下游沉积物中MOB对环境变化更敏感.而MOB在夏季和冬季的集聚系数均较高，表明季节变化对微生物群落的聚集程度影响较小(表 2).共现网络结构图可以表征物种与环境因子之间的正负关系，表征OTUs与环境因子之间联系的紧密程度[44].北运河MOB的共现网络结构图中(图 5)，OTUs与氮素之间的联系程度存在空间差异性，这与沉积物中氮素的空间差异性一致.有研究表明，外源氮对MOB氧化作用的影响主要依赖于环境中氮的存在形态[9].因此，MOB与环境因子的联系程度依赖于北运河沉积物中氮素的主要存在形态.
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表 2 北运河MOB共存关系拓扑结构参数 Tab.2 Topological parameters of microbial network of MOB in the North Canal |
根据Pearson相关性分析(表 3)，MOB的生物多样性指标与NH4+-N、NO3--N和NO2--N、TN及TOC有显著的相关关系(P＜0.05)，其中NO2--N、NH4+-N与MOB的系统发育树ClusterⅠ分支相关关系显著.外源氮素的添加通过改变MOB生长所需要的有机营养物质对其生物多样性产生影响[47].结合系统发育树分析结果，ClusterⅠ为MOB最大的分支，其高同源性菌群主要来自生物反应器和废水淤泥，有研究表明北，运河中的NH4+-N主要来自生活废水和工业废水的排放[15].因此，北运河中高含量NH4+-N的来源影响了沉积物中MOB的来源.
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表 3 MOB多样性指标与环境因子的Pearson相关性 Tab.3 Pearson's correlations between microbial pmoA diversity of MOB and environment factors |
CCA分析进一步探讨MOB群落分布与氮素的响应关系(图 7). CCA分析的轴1和轴2的解释变量分别为46.51 %和29.74 %，前两轴的总解释变量为76.25 %.依据Monte Carlo检验，选择6个与解释轴有强相关的环境因子，其中TDS(0.99)、Salinity(0.98)、NO3--N(0.97)、NH4+-N(0.95)和TN(0.88)均与轴1有显著相关关系，NO2--N(0.98)与轴2有显著相关关系.北运河夏季和冬季样点基本分布在轴1，与NH4+-N、NO3--N等环境因子有强响应关系.依据Mantel检验(表 4)，NH4+-N和TN对沉积物中MOB群落分布有显著影响(r>0.4, P＜0.01)，而NO3--N和NO2--N对MOB群落分布没有显著相关性(P>0.05). Mantel检验的结果证明，环境中氮素的主要存在形态对MOB群落分布的影响显著.
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图 7 北运河MOB与环境因子的RDA分析 Fig.7 The correlation analysis between MOB with environmental factors in the North Canal |
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表 4 MOB群落组成与环境因子相关关系的Mantel检验 Tab.4 Mantel correlations highlight the relationships between environmental trait and MOB community composition |
生态系统中外源氮素的输入对MOB的氧化有抑制作用，抑制作用的强弱主要依赖于氮素的主要存在形态和浓度水平[48-49].农田氮肥的施用，尤其是NH4+会对MOB的氧化起抑制作用，降低甲烷的氧化速率[13, 50-53]，NH4+的抑制作用主要通过与甲烷竞争甲烷氧化酶系统相同的位点，减少甲烷氧化酶的有效性途径来抑制MOB对甲烷的氧化[13, 52].本研究中NH4+-N为北运河沉积物中氮素的主要形态，NH4+-N和NO3--N均对MOB的群落特征有显著影响，且NH4+-N的影响作用强于NO3--N的影响作用.有研究表明，不同氮素形态对甲烷的氧化作用产生不同的影响，与相同含量的NO3--N相比，NH4+-N对甲烷氧化速率的抑制作用更强，本文与其研究结果一致. NH4+-N对甲烷化氧化的抑制率与其在环境中的含量呈正相关关系[51, 54].北运河由于受到人类活动的影响，加剧了NH4+-N、NO3--N和NO2--N的汇入，扩大了对MOB群落结构及其来源的影响，进一步影响了MOB对甲烷的氧化过程.外源NH4Cl和NH4NO3的输入除了抑制甲烷的氧化作用外，还分别使甲烷产生速率提高了136.7 %和136.55 % [55].因此，研究城市河流中高含量的NH4+-N对甲烷产生及消耗影响是控制河流温室气体排放的关键.
3 结论北运河沉积物中NH4+-N为氮素的主要形态，其存在显著的空间差异性，下游沉积物中NH4+-N含量显著高于上游. NH4+-N含量的变化对MOB群落的空间分布有影响，NH4+-N含量的空间分布特征与MOB的群落聚类特征一致.
北运河NH4+-N的来源影响了MOB的系统发育和MOB的主要菌种，MOB高同源性菌群来源与NH4+-N的来源一致，其在系统发育树各分支中的主导菌种与NH4+-N的来源中主要菌种一致.
MOB的OTUs之间联系的紧密程度依赖于北运河沉积物中氮素的主要存在形态及其含量水平. NH4+-N含量较高的下游沉积物中MOB的OTUs之间相关关系更强，其对环境变化更敏感，受到环境变化干扰的影响程度更高.
氮素对MOB的影响主要依赖于氮素在环境中的主要存在形态.北运河沉积物NH4+-N与MOB群落分布有显著的响应关系，是沉积物中MOB群落分布的主要影响因素.
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